蒙药乳腺-Ⅰ号对大鼠乳腺增生组织中Prdx-1、GSTP和SOD蛋白表达的影响

王忠超 麻莹 宋晓环 姚晓媛 朱莉 魏成喜 张彬

(1长春医学高等专科学校病理教研室，吉林 长春 130031；2吉林大学植物科学学院；3内蒙古民族大学医学院；4内蒙古民族大学附属医院心胸外科)

乳腺增生症本质是非感染性慢性炎症及非肿瘤性肿物的病变，目前发病率逐年升高，并趋向年轻化。蒙药乳腺-I(M-I)号是内蒙古自治区治疗乳腺增生症的传统秘方〔1〕。通过对M-Ⅰ号处理后的大鼠乳腺组织进行荧光差异双向凝胶电泳(DIGE)和质谱鉴定，在大鼠乳腺组织中检测出16种与M-Ⅰ号治疗相关的蛋白，其中3种蛋白〔过氧化物酶(Prdx)-1、谷胱甘肽S转移酶(GSTP)、超氧化物歧化酶(SOD)〕与氧化损伤相关〔2〕。本实验拟进一步探讨M-Ⅰ号对乳腺增生症的治疗机制，为推进蒙药的开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1动物及主要试剂 雌性未孕Wistar大鼠(体重200～220 g)购自长春市亿斯实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK-(吉)2016-0003。苯甲酸雌二醇注射液，购于杭州动物药品厂；黄体酮注射液，购于浙江仙居制药股份有限公司；Prdx-1，GSTP,SOD多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG，均购于上海善然生物有限公司。

M-Ⅰ号(哲卫药准字：9604-79)处方由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室提供。大鼠给药剂量根据临床药物剂量换算而得。

1.2分组及给药 雌性未孕Wistar大鼠40只，随机选出8只作为正常对照组，其余动物每日1次肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg连续25 d，随后每日1次肌肉注射黄体酮4 mg/kg连续5 d，用于复制大鼠乳腺增生模型；同时，正常对照组大鼠肌肉注射橄榄油。模型复制成功后，随机分为3组(每组8只)并给予相应处理，模型对照组给予生理盐水灌胃；M-Ⅰ号低剂量组给予M-Ⅰ号0.5 g/kg，高剂量组给予M-Ⅰ号3.0 g/kg灌胃，期间正常对照组给予生理盐水灌胃，每天观察大鼠状态。给药4 w后，禁食12 h，取大鼠左侧乳腺组织用4%多聚甲醛固定。

1.3大鼠乳腺组织病理学检查 大鼠乳腺组织进行固定、脱水、石蜡包埋、切片和苏木素-伊红染色后在纤维镜下观察分析，对大鼠乳腺增生情况分级：轻度增生：小叶内纤维组织增多，腺泡扩张，数量增多，但腺泡及导管上皮无增生；重度增生：不仅腺泡数目增多，且腺泡扩张及分泌现象严重，导管上皮出现多层或乳头状改变；将正常、轻度、重度增生依次计为1、2、3分，对各组平均积分进行统计。

1.4免疫组织化学方法检测大鼠乳腺组织中Prdx-1,GSTP,SOD的表达 按照pv-6000通用型二步法检测试剂盒操作步骤测定：先将组织切片进行脱蜡和水化；3% H2O2去离子水孵育10 min；滴加一抗后室温孵育2 h，用配好的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次；滴加亲和素室温孵育20 min，PBS冲洗3次；滴加生物素-HRP室温孵育30 min，PBS冲洗3次；应用二氨基联苯胺(DAB)溶液显色；自来水充分冲洗后苏木素复染。采用Motic Images Advanced3.2软件分析Prdx-1,GSTP,SOD免疫组织化学图像中目标总面积占选区总面积的百分比。

1.5统计学分析 采用SPSS11.5软件行t检验。

2 结 果

2.1M-Ⅰ号对大鼠乳腺组织Prdx-1,GSTP,SOD 表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组乳腺组织中Prdx-1和GSTP水平显著升高(P<0.01或P<0.05)，SOD水平显著降低(P<0.05)，差异均有统计学意义；与模型对照组大鼠比较，M-Ⅰ号高剂量组Prdx-1、SOD水平明显降低接近于正常对照组，GSTP水平仍高于正常对照组和模型对照组大鼠。见表1，图1。

表1 各组乳腺组织Prdx-1,GSTP,SOD表达比较

与正常对照组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;与模型对照组比较：3)P<0.05,4)P<0.01

图1 各组乳腺组织中Prdx-1、GSTP和SOD的表达(HE，×400)

2.2大鼠乳腺组织病理学特征分析 纤维镜下可见，正常对照组大鼠乳腺小叶呈散在分布，数量无明显增高，腺泡未见扩张和增多、腺腔内无分泌物或仅有少许分泌物。模型对照组乳腺增生明显，表现为乳腺小叶数量增多，腺泡及导管大量增生，腺泡高度扩张并且分泌旺盛，导管上皮呈多层和(或)乳头状改变。和模型对照组比较，M-Ⅰ号各剂量组乳腺小叶数及腺泡数均少于模型对照组，乳腺腺泡数目及腔内分泌物较少，导管管腔变小，体积缩小；M-Ⅰ号高剂量组中少数大鼠的乳腺结构接近正常大鼠。模型对照组乳腺组织病理学评分〔(2.68±0.31)分〕明显高于正常对照组〔(1.00±0.00)分，P<0.01〕，M-Ⅰ号低剂量组〔(1.78±0.49)分〕、高剂量组〔(1.24±0.67)分〕的病理学评分显著低于模型对照组(P<0.05，P<0.01)。

3 讨 论

M-Ⅰ号是内蒙古自治区治疗乳腺增生症的传统秘方，经多年临床观察，疗效安全可靠，是治疗乳腺增生症的良方〔2〕。本实验通过复制实验动物模型证明M-Ⅰ号对大鼠乳腺增生组织有明显的改善作用，并能够通过改变Prdx-1、GSTP、SOD 的表达来治疗乳腺增生。

Prdx是细胞内存在的一类抗氧化酶，对其认识最初在于它们能催化氧化还原反应使细胞里面过氧化氢水平保持恒定，这对于细胞进行正常活动和功能十分重要〔3〕。越来越多的证据表明，Prdx-1与多种恶性肿瘤的发生发展、侵袭和转移密切相关〔4〕；但至今为止Prdx-1在乳腺癌中的潜在作用仍然非常模糊。Bajor等〔5〕研究表明Prdx-1可作为人类乳腺癌的生物标志物，Prdx-1下调显著降低了MCF-7和ZR-75-1乳腺癌细胞的生长速度；当 Prdx-1在乳腺癌组织中高表达时，增加了乳腺癌的恶性程度。O′Leary等〔6〕研究表明，Prdx-1通过其抗氧化功能，可以防止氧化应激引起的ERα损失，从而可能导致乳腺肿瘤的雌激素受体阳性表型的维护。这证实了Prdx-1的生物学活性与乳腺癌雌激素介导信号的调控密切相关。本实验结果表明，乳腺增生大鼠乳腺组织中 Prdx-1表达明显增高，M-Ⅰ号治疗后Prdx-1表达明显下降，提示Prdx-1参与了雌激素诱导的大鼠乳腺增生发生过程，而M-Ⅰ号能通过调节Prdx-1的表达改善乳腺增生的病理变化。

GSTP是GSTs蛋白超家族中最重要的亚族，在解毒、抗氧化、抗炎症等过程中发挥着重要作用〔7，8〕。在本研究中，模型对照组大鼠乳腺组织中GSTP 表达明显高于正常对照组，当给予M-Ⅰ号治疗后GSTP的表达明显高于模型对照组，推测在大鼠乳腺增生组织中，氧化损伤或毒性物质的作用使GSTP代偿性表达增强，而M-Ⅰ号能够促进GSTP的表达。有研究表明，乳腺癌组织与癌旁组织比较，GSTP的表达明显减少，主要原因是GSTP基因甲基化发生率升高〔9,10〕。M-Ⅰ号促进GSTP表达的过程是否参与了抑制GSTP基因甲基化的过程，还有待进一步研究。

SOD为自由基清除剂，能有效减轻由于自由基过量引起的脂质过氧化、细胞膜损伤、炎症、肿瘤等的发生。在本研究中，模型对照组大鼠乳腺组织中SOD表达明显低于正常对照组，当给予M-Ⅰ号治疗后SOD的表达明显高于模型对照组大鼠，说明M-Ⅰ号能有效增加SOD的表达，通过减少自由基而减少氧化损伤对机体的影响。

综上，M-Ⅰ号不仅可以明显改善乳腺增生大鼠乳腺组织结构，还可以通过上调SOD、GSTP的表达、下调Prdx-1的表达而发挥治疗作用。