中药塌渍对膝骨关节炎兔MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc表达的影响

唐芳 马武开 卢向阳 肖丽娜 周静 徐晖

(贵阳中医学院 1第二附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550001；2研究生院)

膝骨关节炎(KOA)是一种以膝关节软骨退行性改变为主的慢性疾病，主要由关节软骨、滑膜及关节周围肌肉损伤和骨质增生为特征，临床主要表现为膝关节疼痛、肿胀、活动受限，该病发病机制尚不清楚，多数研究表明其与年龄、性别和体重等密切相关〔1，2〕。目前临床上对KOA的治疗方法，主要以改善关节症状，延缓关节退变程度为主，严重者采取膝关节置换术。中药塌渍疗法作为我国传统的中医外治方法，早已广泛应用于临床，且已被证实治疗KOA有效〔3，4〕。最新研究发现Wnt/β-catenin信号通路与KOA发病密切相关，其下游基因的表达水平与KOA关节软骨退变程度有直接相关性〔5〕。据此我们在前期临床和实验研究的基础上进一步验证中药塌渍疗法治疗KOA是否与其影响Wnt/β-catenin信号通路下游基因表达水平相关。为验证该假说，我们通过建立兔KOA模型，探讨不同温度的中药塌渍疗法对KOA模型兔关节软骨基质金属蛋白酶(MMP)-3、MMP-13、骨形态发生蛋白(BMP)-2、cylinD1、c-myc表达水平的影响。

1 材料及方法

1.1实验动物及条件 健康新西兰兔72只，雌雄各半(分笼饲养)，体重(2.05±0.51)kg，由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2012-0001。喂养饲料来源：贵州省农业科学院。实验兔均进行1 w的适应期喂养，然后开始实验。

1.2试剂及药品 TRIzol总RNA提取试剂(天根生化科技有限公司，批号：DP405-02)、50 bp DNA Laddder(Solarbio，货号：M1800)、PrimeScriptTMRT试验盒(TaKaRa，批号：RR047B)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，ROX plus(TaKaRa，批号：RR82LR)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa，批号：3427Q)、双氯芬酸二乙胺乳胶剂(扶他林，北京诺华制药有限公司，国药准字号：H19990291)、中药溻渍疗法中药(活血通痹汤：方由透骨香、黑骨藤、海桐皮、透骨草、川芎、防风、白芷、乳香、没药、红花、当归、大血藤等药组成)，由贵阳中医学院第二附属医院中药房提供。

1.3仪器 涡旋振荡仪(QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、离心机 (Centrifuge 5415D，Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI7500，Applied Biosystems)、分光光度计(NANODROP 2000，Thermo scientific)、凝胶成像系统(Tanon 1600，上海天能科技有限公司)、-80℃冰箱(DW-HL388、中科美菱)。

1.4动物模型制作 采用随机数字表法将新西兰兔随机分为6组，每组12只，分别为空白组、模型组、扶他林组、42℃中药塌渍治疗组、37℃中药塌渍治疗组、32℃中药塌渍治疗组。适应期喂养结束后，采用石膏管型固定法〔6〕用管型石膏和小铝板将兔膝关节固定在伸直位，限制膝关节活动，制作兔KOA模型，造模时间为4 w。第5周起3个中药塌渍组(42℃、37℃、32℃)将提前准备好的中药用恒温锅维持相应的温度恒定不变，将纱布裁剪合适大小后放入中药中浸泡后拧至药液不滴出，敷于兔造模膝关节上，每5 min更换1次纱布以维持塌渍温度，每次塌渍20 min，每天1次；扶他林组是每次挤出约20 mg扶他林软膏均匀涂擦于造模膝关节，并轻轻揉搓2～4 min；空白组和模型组正常饲养，给药时间4 w。

1.5关节软骨病理观察 外治干预治疗4 w后采取空气栓塞法处死动物，先解剖造模膝关节，肉眼大体观察关节软骨表面，然后取各组兔膝关节软骨制作标本。经中性甲醛固定，硝酸脱钙，常规石蜡包埋，切片，HE染色，由专人观察各组标本病理。软骨病理改变参考Mankin进行评分〔7〕。

1.6RT-PCR法检测MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达水平 引物由北京Invitrogen公司合成，见表1。

表1 目的基因引物序列

将软骨组织尽量剪碎充分裂解后，采用Trizol提取细胞总RNA，具体按TRIzol总RNA提取试剂说明书进行。提取的RNA使用NanoDrop®ND-2000测定浓度和纯度，cDNA产物在20 μl体系中进行，设定反应条件，取10 μl PCR扩增产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像分析仪分析。用Bandscan4.0软件进行灰度扫描。用总灰度表示各条带mRNA表达量，比较各泳道目的条带与相应内参的灰度比，作为各目的条带mRNA的相对含量。取3次独立电泳的灰度比，计算平均值。

1.7统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析及非参数检验。

2 结 果

2.1关节表面大体观察 空白组可见关节表面光滑，有光泽富有弹性，未见裂痕，关节未见明显肿胀、增生和滑膜充血；模型组可见关节面粗糙不平整，色泽暗淡，软骨较薄伴有糜烂，关节明显肿胀和明显增生、滑膜充血；治疗组关节表面情况均好于模型组但差于空白组，治疗组组内比较，42℃中药塌渍组关节表面较光滑，轻度关节肿胀和滑膜充血，较其他治疗组稍好，而37℃中药塌渍组、扶他林组、32℃中药塌渍组均可见关节表面不平整，伴有关节肿胀和滑膜充血，肉眼观察差异性不明显。

2.2病理结果

2.2.1病理图片 光镜下可见空白组软骨表面光滑，软骨细胞数量较多，分布均匀，排列整齐，潮线完整；模型组软骨较薄，表面粗糙，伴有列缺，细胞数目较少，排列紊乱，局部聚集明显，染色不明显，潮线模糊；治疗组在软骨表面光滑程度、细胞数目、分布、染色情况及潮线均好于模型组差于空白组，治疗组组内比较，42℃中药塌渍组镜下软骨表面较光滑，细胞数目较多，分布较均匀，可染色，潮线模糊但有层次，较其他治疗组稍好，而37℃中药塌渍组、扶他林组、32℃中药塌渍组可见较少的细胞数量，分布比较乱，有局部细胞积聚，潮线较模糊，见图1。

图1 各组部分病理图片结果(HE，×200)

2.2.2Mankin评分结果 模型组兔膝关节软骨组织病理Mankin评分〔(11.00±0.82)分〕与空白组〔(1.50±0.50)分〕比较明显升高(P<0.01)；治疗组Mankin评分均明显低于模型组(P<0.01)，高于空白组(P<0.05)；治疗组组内比较Mankin评分从低到高依次是42℃中药塌渍组〔(3.00±0.82)分〕、37℃中药塌渍组〔(4.75±0.83)分〕、扶他林组〔(5.75±0.82)分〕、32℃中药塌渍组〔(7.50±1.12)分〕，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3不同组软骨组织MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达水平比较 模型组MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达量均最高，空白组均最低，模型组与空白组有显著差异(P<0.01)；治疗组其 mRNA的表达量均低于模型组高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；治疗组内比较，42℃中药塌渍组MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达量均最低，其次从低到高依次是37℃中药塌渍组、扶他林组、32℃中药塌渍组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同组MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达量

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；治疗组组内比较：3)P<0.05

3 讨 论

KOA形成的主要原因是膝关节软骨降解、骨赘形成和软骨损伤等，为了研究其形成的具体机制，人们发现Wnt/β-catenin信号通路与KOA的发生发展有着密切的关系〔8，9〕。而Wnt/β-catenin信号通路的作用途径是当该信号通路被激活时，通过抑制降解复合物减少β-catenin的降解，使积累的β-catenin进入细胞核内与转录因子结合进而促进该信号通路下游基因表达，进而促进软骨细胞的增殖分化和凋亡〔10〕。所以Wnt/β-catenin信号通路对KOA的调控主要取决于其下游基因的表达，主要有MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc。

MMPs一种由结缔组织细胞分泌并参与细胞外基质降解的蛋白酶，可降解细胞外基质中的胶原、蛋白多肽等〔11〕。而KOA的主要是由于软骨细胞外基质降解所致，所以MMPs在KOA的发生发展中起着重要作用〔12〕。李保驰等〔13〕通过实验发现MMPs蛋白与骨性关节炎发生发展密切相关，且OA患者滑膜中表达明显高于非OA患者。BMPs是一种生长因子，其可通过调节蛋白多糖的合成在软骨保护和修复中发挥重要作用，其中BMP-2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。有研究表明BMPs在早期诱导软骨细胞分化，促进基质合成，促进软骨形成同时也参与了软骨细胞的终末分化过程致使软骨退化，促进OA形成〔14〕。詹宏钢等〔15〕在研究独活寄生汤对KOA的作用机制使发现活寄生汤可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因BMP-2转录，可保护关节软骨，缓解关节疼痛。cyclinD1是细胞周期含量呈周期性变化的细胞周期调节蛋白，其调控细胞周期的进展过程，促进细胞增殖，所以其在正常细胞中处于低水平状态〔16〕。结合其同为Wnt/β-catenin信号通路下游基因，其很有可能与软骨细胞的增值、分化有很大关系。c-myc是一种转录因子，其可调控cyclinD1、cyclinE及p27等细胞周期相关基因的表达，促进细胞生长，c-myc的过度表达使细胞摆脱细胞周期的限制，导致细胞恶化，进入过度增殖的状态。其不仅与肿瘤细胞生长增殖与分化相关，也有软骨细胞的增殖、分化和凋亡相关〔17〕。

本实验表明Wnt/β-catenin信号通路下游基因与KOA的发生发展有着密切关系，中药塌渍法治疗KOA疗效明确，且适宜温度的中药溻渍法治疗效果更佳。而中药塌渍疗法很有可能就是通过调控该信号通路，下调下游基因MMP-3、MMP-13、BMP-2、cylinD1、c-myc mRNA的表达治疗KOA。