编码前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因E670G多态性与中国汉族人群大动脉粥样硬化性卒中的相关性

陈琳琳, 郑秋月, 仲启帆, 陈秋颖,刘筱洁, 于海龙, 陈应柱

(1. 扬州大学临床医学院 神经内科, 江苏省苏北人民医院 神经内科, 江苏 扬州, 225001; 2. 南京鼓楼医院集团仪征医院 神经内科, 江苏 仪征, 215004)

研究[1-4]发现编码前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)的基因突变可引起遗传性家族性高胆固醇血症(ADH)的发生，影响缺血性卒中发生的风险以及氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的生物学特性，从而直接促进动脉粥样硬化的发展。PCSK9 E670G(rs505151)突变是较为常见的突变类型，许多研究发现PCSK9 E670G多态性与缺血性卒中具有相关性，但是来自不同人群及年龄的研究结果却存在差异性。本研究检测动脉粥样硬化型缺血性卒中患者的PCSK9 E670G基因型以及血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平，探讨E670G多态性在动脉粥样硬化型缺血性卒中及其亚型中的发生频率，以及与动脉粥样硬化型缺血性卒中及其亚型的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月—2017年4月苏北人民医院东院神经内科住院治疗的动脉粥样硬化型缺血性脑卒中患者216例为病例组，年龄27～94岁，均为汉族，彼此无亲缘关系。参照疾病国际分类标准第9版(ICD-9)及中国1995年脑血管疾病分类与性卒中。动脉粥样硬化型脑卒中各亚型诊断依据严格的神经学检查、CT及MRI等影像学检查。排除标准: 无症状性脑卒中患者; 其他类型的缺血性脑卒中患者，包括心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他原因型或不明原因型、短暂性脑缺血发作及出血性脑卒中者; 有心脏病史(风湿性心脏病、心肌病等)和房颤的患者; 创伤或血管夹层引起的血管内皮损伤、严重感染、结缔组织病、自身免疫病、代谢病(糖尿病除外)和其他严重的慢性疾患者(如晚期肝硬化、未经治疗的甲状腺机能亢进或减退等)。选取同期苏北人民医院东院神经内科的非脑卒中患者192例为对照组，均为无脑卒中症状的健康体检者，按性别、居住地区、年龄与相应病例匹配，均为汉族，彼此无亲缘关系。排除标准同病例组。

1.2 研究方法

收集病例组与对照组的一般信息，如姓名、年龄、性别、高血压史、糖尿病史、血脂等息。询问病例组与对照组患者的饮食、吸烟、饮酒等生活习惯及既往病史和家族史。抽取病例组和对照组患者空腹12 h的外周静脉血5 mL, 储存在-20 ℃冰箱。血生化指标检测由医学检验中心完成，包括总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇。

1.3 DNA的提取

以人基因组DNA 样品为模板，按已优化好的条件进行10 μL体系的PCR反应，其中引物序列为PCSK9 E670G(上游引物): 5′-CACGGTTGTGTCCCAAATGG-3; PCSK9 E670G(下游引物): 3′-GAGAGGGACAAGTCGGAACC-5′。PCR反应体系: 总反应体系为10 μL, 包括基因组DNA模板5 μL, PCSK9 E670G F(20 μmol/L) 1 μL, PCSK9 E670G R(20 μmol/L) 1 μL, dNTP混合液(2.5 mmol/L) 4 μL, Taq聚合酶0.5 μL, 10X PCR Buffer 5 μL, PCR级超纯水33.5 μL。反应条件: 95 ℃预变性5 min, 随后进行35个循环(95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72℃延伸45 s), 72 ℃再延伸7 min, 4 ℃保存。采用限制性内切酶Ear I进行酶切, 37 ℃温浴过夜，加酶切产物在1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观测电泳结果并拍照。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件包，观察病例组与对照组的临床特征，年龄、性别、吸烟、高血压史和糖尿病史等为计数资料,Pearson卡方(χ2)检验比较组间的差异。年龄、甘油三酯、HDL-C、血浆总胆固醇等指标为计量资料，呈正态分布，采用独立样本Students′t检验比较各组间均数。计算PCSK9基因E670G位点的等位基因频率与基因型频率在病例组和对照组的分布，采用卡方检验判断每个多态位点的分布有无地区、性别差异。采用R×C表的Pearson卡方(χ2)检验进行E670G的位点关联分析。不同基因型间LDL-C水平使用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1 病例组与对照组临床特征比较

病例组与对照组年龄、性别、总胆固醇(TC)比较，差异无统计学意义(P>0.05), 2组在高血压病史、糖尿病史、既往脑卒中史、吸烟史、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)方面有显著差异(P<0.05), 见表1。

表1 病例组与对照组一般资料的比较

与对照组比较, *P<0.05

2.2 PCSK9基因E670G PCR产物酶切结果

PCSK9基因E670G PCR产物酶切结果见图1。

M: DNA 2000 marker; 1～7: samples(1为AA基因型, 2为GG基因型, 3～7为AG基因型)图1 PCSK9基因E670G PCR产物酶切图

2.3 PCSK9基因E670G位点多态性基因型和基因位点的分布

病例组基因型AA、AG、GG的例数依次为40例(18.5%)、124例(57.4%)、52例(24.1%)。对照组基因型AA、AG、GG的例数依次为70例(36.5%)、86例(44.8%)、36例(18.8%)。2组基因型频率分布有显著差异(P<0.05)。病例组等位基因A、G的例数依次为204例(47.2%)、228例(52.8%), 对照组依次为226例(58.9%)、158例(41.1%), 差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 PCSK9基因E670G位点与动脉粥样硬化型脑卒中及其亚型关联性分析

缺血性脑卒中病例组各亚组(动脉-动脉栓塞亚型、穿支动脉口闭塞亚型、低灌注栓子清除功能下降亚型、混合型亚型)的基因型分布无显著差异(P>0.05)。将4个亚组与对照组比较, a组、b组的等位基因G的基因型频率显著增高(P<0.05), GG基因型的频率也显著增高(P<0.05); c组、d组的等位基因G、GG基因型频率与对照组比较无显著差异(P>0.05), 见表2。

2.5 PCSK9基因E670G多态性与LDL-C的相关性

GG基因型(n=52)的患者LDL-C水平为(3.10±0.66) mmol/L, 高于AG基因型(n=124)的(2.70±0.96) mmol/L与AA基因型(n=40)的(2.66±0.50) mmol/L, 差异有统计学意义(P<0.05), 而AG基因型与AA基因型的LDL-C水平比较无显著差异(P>0.05)。

3 讨 论

研究[6]发现，血清中较高水平的LDL-C与动脉粥样硬化、冠状动脉性心脏病(CAD)以及缺血性卒中风险升高相关。在基因因素导致的疾病中，抗利尿激素(ADH)与血液中异常升高的LDL-C浓度以及早期出现的CAD、缺血性卒中相关。编码PCSK9蛋白的基因是与ADH相关的基因，研究[7]发现PCSK9蛋白是肝细胞表面上低密度脂蛋白受体(LDLR)活性的关键调节因素，并且是治疗高胆固醇血症的作用靶点。研究[8-11]表明PCSK9的单核苷酸多态性(SNP)可以显著影响血液中LDL-C的水平，并发现PCSK9 SNP中E670G(rs505151)基因的多态性与颈动脉内中膜厚度、CAD以及缺血性卒中的风险相关。

本研究发现E670G等位基因在大动脉粥样硬化(LAA)型缺血性卒中患者中的发生频率明显高于非卒中患者，在LAA型缺血性卒中各亚型分析中, E670G等位基因在动脉-动脉的栓塞亚型、

表2 PCSK9基因E670G等位基因与基因型频率分布[n(%)]

a组: 动脉-动脉栓塞亚型; b组: 穿支动脉口闭塞亚型; c组: 低灌注栓子清除功能下降亚型; d组: 混合型亚型。

与对照组比较, *P<0.05。

穿支动脉口闭塞亚型的卒中患者中的发生频率与非缺血性卒中患者有显著差异。提示PCSK9 E670G等位基因是LAA型缺血性卒中的易感性基因, PCSK9 E670G等位基因可以增加LAA型缺血性卒中的风险，且主要发生在动脉-动脉栓塞、穿支动脉口闭塞亚型中。Abboud等[12]研究发现, E670G等位基因与LVA型卒中风险相关，而与SVO型卒中无相关性。Au等[13]在1项Meta分析中也曾报道, OLR1基因中的rs11053646与PCSK9 E670G(rs505151)的多态性与缺血性卒中易感性风险增加相关。Han等[14]研究揭示了PCSK9 rs505151的基因多态性与缺血性卒中风险并无明显相关性，这可能与选取的缺血性卒中患者类型有关，以上研究均未对缺血性卒中进行TOAST分型，而研究结果也只是在LAA型卒中患者中得到了rs505151基因多态性与卒中风险的相关性，在其他类型的卒中患者中并未得到一致的结果。人群种族来源以及地理环境的差异也可能导致结果的不一致性。

本研究还发现，血液中具有较高LDL-C水平的E670G等位基因携带者，其发生LAA型缺血性卒中的风险更高。推测LAA型卒中患者血液中LDL-C水平的升高，可能与LDL-C可以被氧化修饰成ox-LDL, 而ox-LDL能够诱导血管内皮细胞活化以及功能异常、巨噬细胞及平滑肌细胞的迁移[15-16], 导致局部炎症反应、氧化应激、坏死以及凋亡的发生[17], 从而促进动脉粥样硬化的发生、发展密切有关[18-19]。炎症反应可进一步促进平滑肌细胞分泌PCSK9，而PCSK9不仅在泡沫细胞形成以及动脉粥样斑块进展中发挥着重要的作用[20], 其还能促使低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)活化，从而促进平滑肌细胞对ox-LDL摄取，引起炎症反应的级联放大，促进动脉粥样硬化的进展[21]。此外, PCSK9 E670G等位基因突变可使PCSK9与肝细胞表面的LDLR亲和力增加，促进LDLR降解，导致血液中LDL-C升高，也可促进动脉粥样硬化的发展，间接升高LAA型卒中的风险。另外, PCSK9和ox-LDL可通过其他的机制相互作用，促使血管内皮细胞凋亡，可能与动脉粥样硬化发展有关。

总之，本研究结果表明, PCSK9具有直接以及间接促进动脉粥样硬化发生、发展的作用。PCSK9 E670G等位基因可能是动脉粥样硬化型缺血性卒中的新的危险因素，主要在TOAST分型动脉-动脉栓塞、穿支动脉口闭塞亚型中比较明显，为动脉粥样硬化型缺血性卒中的风险评估提供了新的方向。