TGF-β1/Smads信号通路及其与肾脏纤维化关系的研究进展

黄秀，张洋洋，朱晓宇，曾榃伦，杜玉君

(吉林大学第一医院，长春 130021)

肾脏纤维化是指由各种病因造成的受损肾脏组织内纤维结缔组织(细胞外基质成分如胶原和纤连蛋白)的过度积聚，是慢性肾脏病(CKD)发生发展的中心环节及病理学标志，也是CKD进展至终末期肾病的最终及共性特征。肾脏纤维化主要表现为肾小球硬化、肾间质纤维化及肾血管硬化[1]，在此基础上，感染、毒素、遗传性疾病、自身免疫、心肌梗死、高血清胆固醇、肥胖等多种因素加剧了肾脏纤维化的进展，最终加快肾脏瘢痕形成、功能衰竭，直至终末期肾衰竭。尽管肾脏纤维化会带来致命性后果，但由于其影响因素众多且缺乏精准的生物标志物，故在早期不易被识别，从而使相关疾病发病率及住院率居高不下，并且成为世界各国的一个主要公共卫生问题。流行病学显示，2018年美国CKD发病率占其人口总数的15%[2]；仅2015年，我国因肾脏疾病住院的人数占全国总住院人数的4.8%[3]。目前仍无有效的治疗措施来阻止肾脏纤维化。因此，明确肾脏纤维化的发病机制对于预防及早期干预肾纤维化具有至关重要的意义。已有研究表明，细胞内关键信号通路(如TGF-β1/Smads，Wnt/β-连环蛋白，Jagged/Notch，表皮生长因子受体和JAK/STAT)失常在肾脏纤维化中发挥重要作用。其中，TGF-β1/Smads信号通路是肾脏纤维化的关键调节者[4]，本研究中我们就TGF-β1/Smads信号通路及其与肾脏纤维化关系的研究进展作以下综述。

1 TGF-β1/Smads信号通路

1.1 TGF-β1TGF-β超家族由De Larco和Todaro于1978年在研究病毒时发现，它包括TGF-βs、激活素、生长分化因子、骨成形蛋白(BMPs)等33个结构相似但功能迥异的成员，主要通过调节细胞生长、上皮-间质转化、细胞外基质重塑和免疫反应等生理及病理过程，在组织稳态、癌症、炎症、纤维化的发生中发挥重要作用。近年研究表明，TGF-β超家族中，TGF-βs与肾脏纤维化关系最为密切。在哺乳动物体内，虽然TGF-βs存在3种高度同源的异构体：TGF-β1、2、3，且三者的氨基酸序列相似度高达64%～82%，但三者在肾脏组织中的分布及功能差异较大。TGF-β1在所有类型肾脏细胞中广泛表达，且是发挥抗纤维化作用的主要因子；而TGF-β2和TGF-β3主要在肾小球的足细胞中表达，对纤维化的调节目前仍存在争议。有研究[5]表明，TGF-β2可刺激大鼠近端小管上皮细胞的纤维化；亦有研究[6]发现，在人足细胞中加入TGF-β2，其可通过增强鞘氨醇激酶-1活性发挥抗纤维化作用。但无论是发挥抗纤维化还是促纤维化作用，TGF-β超家族是通过激活细胞膜上具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的跨膜受体激活Smads蛋白发挥信号传导作用的。

1.2 Smads蛋白 Smads蛋白是Mad蛋白和秀丽隐杆线虫小蛋白的组合，根据其在TGF-β1/Smads信号通路中的功能不同，将人体中发现的Smads蛋白分为3类：受体调节型Smads(R-Smads)：Smad1、2、3、5、8；共同通路型Smad(Co-Smad)：Smad4；抑制性Smads(I-Smads)：Smad6、7。作为一种细胞内信使，Smads蛋白可将细胞外信号转导至细胞核，进而激活下游基因转录。8种Smad蛋白均由氨基末端的MH1结构域、羧基末端MH2结构域及中间接头区(linker)组成。其中，MH1结构域的主要功能是结合DNA，为信号转导的抑制性结构域；MH2结构域主要作用是与活化的TGF-β受体结合，是信号转导的功能性结构域，此外其还可与其他Smad、不同谱系确定转录因子、染色质阅读器、共激活因子及共抑制子结合。越来越多的证据[7]表明，磷酸化、泛素化、SUMO化和乙酰化等Smad翻译后修饰在肾脏纤维化中起一定作用。此外，有研究表明，虽然在哺乳动物中R-Smads、Co-Smad三个结构域高度保守，但I-Smad基因MH1结构域在不同物种间的保守性却较低，并且Smads基因在某些肿瘤中存在不同程度的突变。因此，进一步探索Smad基因突变位点可能成为肾脏纤维化治疗的突破点。

1.3 TGF-β1与Smads蛋白之间的作用 新合成的TGF-β以无活性形式存在，通过裂解邻近的N-端释放出潜在相关肽(LAP)，LAP与成熟的TGF-β通过非共价键连接成同源二聚体，形成小的潜在复合物(SLC)。SLC再与潜在TGF-β结合蛋白形成大的潜在复合物(LLC)。LLC可使TGF-β处于无活性状态，不能与Ⅰ型或Ⅱ型受体结合发挥自身作用。特定蛋白酶、血小板反应素、αVβ6、活性氧(ROS)、低pH可通过许多未知的机制潜在激活TGF-β，进而发挥生物学效应。研究[8]表明，αVβ6能够通过物理牵引应力使LLC结构变形，从而释放出有活性的TGF-β。此外最新研究[9]表明，在调节性T细胞表面和血小板内以糖蛋白A为主的重复序列亦可潜在激活TGF-β1，这一新的重大发现可能为深入理解肾脏纤维化的发病机制提供新的线索。TGF-β被上述机制激活后，通过与具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的Ⅰ型受体和Ⅱ型跨膜受体结合成复合物后将信号传至细胞内。目前研究表明,人类基因组包含7种Ⅰ型受体和5种Ⅱ型受体，其中TGF-β Ⅰ型受体也称为激活素受体样激酶5(ALK5)。这12个成员中的ALK5和ALK1与TGF Ⅱ型受体主要参TGF-β1/Smads信号通路转导，具体机制为被激活的TGF-β首先与TGF Ⅱ型受体结合成为活化型，其次TGF Ⅱ型受体使TGF Ⅰ型受体的GS结构域磷酸化(Ⅰ型受体C-端的一个富含甘氨酸及丝氨酸的结构域)，从而激活TGF Ⅰ型受体，活化的TGF Ⅰ型受体直接使Smad2/3磷酸化，干扰Smad2/3 MH1结构域与MH2结构域之间的相互作用，使Smad2/3可通过MH2进一步与Smad4结合形成异源寡聚体复合物，转移至细胞核与各种转录因子(共激活因子和共抑制因子)相互作用以调节靶基因的转录活性，进而启动经典Smad和非经典Smad信号通路的转导。

2 TGF-β1/Smads信号通路与肾脏纤维化的关系

2.1 TGF-β1的上下游因子与肾脏纤维化 TGF-β1是纤维化过程的驱动因子，已有研究表明，肾脏病理改变有纤维化的人及动物体内TGF-β1水平增加。Suthanthiran等[10]发现非裔美国人血清中的TGF-β1水平与其肾脏疾病风险呈正相关。Catherine等[11]进一步发现，在糖尿病肾病小鼠体内TGF-β1高表达可加剧疾病的进展。众多研究者发现，TGF-β1调控肾脏纤维化的基本机制如下：刺激肌成纤维细胞的大量合成从而诱导上皮-间质转化；刺激肾脏固有细胞(如：上皮细胞、系膜细胞、内皮细胞、巨噬细胞和周细胞等)的活化及向成纤维细胞转变；刺激细胞外基质的沉积及抑制其降解；促进肾小管细胞的凋亡及缺失。虽然肾脏纤维化的基本机制已得到阐述，基于上述机制在实验模型中开展的关于TGF-β1的临床前研究显示，TGF-β1具有抗纤维化作用，但将其运用到肾脏纤维化患者体内后的疗效并未令人满意。故研究者可着眼于TGF-β1的上下游因子，从而为肾脏纤维化的治疗开发更有效的方法。

近年研究表明，不同表型的巨噬细胞通过与TGF-β1相互联系对肾脏纤维化发挥不同作用。Shen等[12]发现，小鼠单侧输尿管梗阻模型中，肾脏损伤早期主要是促炎型(M1型)巨噬细胞通过促进TGF-β1等细胞因子的分泌及活化进而促进细胞外基质的积聚和纤维化的发生。在疾病的后期，Ostuni等[13]发现抗炎型(M2型)巨噬细胞通过抑制局部CD4+T细胞反应和减少细胞外基质的产生来减缓纤维化的进展；相反，同样以单侧输尿管梗阻小鼠为模型，Pan等[14]发现肾损伤后募集的巨噬细胞被极化为M2型，其释放高水平TGF-β1增强上皮-间质转化诱导的肾脏纤维化。目前，两种表型的巨噬细胞激活状态通过TGF-β1对肾脏纤维化的作用仍存在较大争议[15]，但近几年关于巨噬细胞和TGF-β1在肾脏纤维化中相互作用的研究日益增加，这可能是减轻肾脏纤维化的有效策略。

最近证据表明，除巨噬细胞的异质性与TGF-β1上游关系密切外，在HIV相关CKD的小鼠模型中，同源域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)可能通过激活TGF-β1从而促进肾小管上皮细胞中纤维化标志物的表达；相反通过抑制HIPK2活性可阻止TGF-β1相关的肾脏纤维化进程[16]。

此外，也有研究提出TGF-β1的上游还与肾素-血管紧张素系统(RAS)密切相关。RAS中的AngⅡ是TGF-β1产生和活化的诱导物，且该系统的多个新轴与TGF-β关系密切，如ACE2 -Ang(1-7)-Mas受体轴可减弱TGF-β1的表达及其诱导的纤连蛋白的产生；肾素原-肾素受体-细胞内途径轴可刺激TGF-β、纤连蛋白和纤溶酶原激活物抑制因子-1的表达[17]。总之，巨噬细胞、HIPK2及RAS均在TGF-β信号通路的上游通过某种机制参与肾脏纤维化的发生、发展。

除TGF-β信号通路的上游与肾脏纤维化关系密切外，另有证据表明，TGF-β1的下游也参与肾脏纤维化的调控。在肾脏纤维化的发病机制中TGF-β1与ROS关联。研究发现，TGF-β1一方面通过诱导NADPH氧化酶依赖性NOX4的mRNA和蛋白质表达进而促进ROS的产生，另一方面还可抑制抗氧化酶的活性双重介导肾脏纤维化的发生[18]，并且是Smad3依赖性的。此外也有研究发现，当机体发生如尿路梗阻、缺血再灌注、高血压等损伤后，肾小管上皮细胞产生细胞因子TGF-β1和趋化因子CCL21/CXCL16/CCL2，趋化因子通过协同作用可募集骨髓来源的T细胞、单核细胞和纤维细胞，TGF-β1通过激活Smad3以刺激单核细胞向成纤维细胞转变[19]，进而促进肾脏纤维化。另有Bai等[20]通过研究白藜芦醇对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)的作用发现，TGF-β1能够激活Hh-Gli信号通路参与肾脏纤维化。在此基础上进一步探究TGF-β1下游的这些因子干预肾脏纤维化的精准靶点将有利于阻止肾脏纤维化的进展。总之，在肾脏纤维化中，TGF-β1的上下游因子发挥关键作用。

2.2 Smads与肾脏纤维化 虽然Smad2和Smad3氨基酸序列具有90%以上的同源性，但其对于肾脏纤维化的作用却不尽相同。在Smad3+/-基因敲除的糖尿病小鼠体内，肾小球硬化降低[21]；另外其特异性抑制剂亦可减少单侧输尿管梗阻性肾病小鼠的肾脏纤维化[22]，这间接提示Smad3可促进肾脏纤维化的发生，其机制可能为通过上调金属蛋白酶组织抑制剂同时下调基质金属蛋白酶的活性来抑制细胞外基质的降解，也可能通过直接与基因启动子中Smad结合元件结合从而促进纤维化的发生。Chen等[23]发现，Smad3可激活骨髓来源的成纤维细胞介导肾脏纤维化：以梗阻性肾病小鼠为模型，敲除Smad3后肾脏组织中积累的骨髓来源的成纤维细胞、肌成纤维细胞活化，α-SMA的表达显著减少；并且发现Smad3的缺失减少了胶原蛋白的沉积并抑制了细胞外基质蛋白的表达。由于Smad2基因敲除的胚胎致死性，限制了研究者对Smad2单独作用的深入探究。Meng等将Smad2-Flox/Flox小鼠与肾脏特异性(Cadherin-16启动子)cre小鼠杂交，并从肾小管上皮细胞敲除Smad2，以此Smad2基因敲除杂交小鼠为模型，进一步研究发现Smad2基因缺失可促进TGF-β/Smad3信号转导并造成严重的肾小管间质纤维化，其机制可能为Smad2可通过竞争性抑制Smad3磷酸化、核转位、转录活性及其与靶基因的结合而起到抑制Smad3介导纤维化的作用；另外Smad2的缺失增加了TGF-β1的自诱导[24]。

Smad4是TGF-β和BMP信号通路的共同组成，在Smad2/3和Smad1/5/8的核浆穿梭中起到转录共激活因子的作用[25]。研究表明，在肾小管上皮细胞中条件性敲除Smad4会显著降低单侧输尿管梗阻小鼠的纤维化程度[26]。在糖尿病的体内及体外模型中，Zhao等[27]通过外界干预使Smad4下调从而减少了肾小球系膜基质的积聚。

大量研究表明，Smad7在肾脏纤维化中发挥负性调节作用。鞘氨醇激酶-2缺乏可通过增加单侧输尿管梗阻小鼠Smad7的表达改善肾脏纤维化[28]。此外，在血管紧张素转化酶Ⅱ诱导的高血压性肾病小鼠模型中，使用非侵入性超声-微泡介导法将Smad7基因转移至小鼠体内，使Smad7过表达，可阻断肾脏纤维化[29]。Smad7的抗肾脏纤维化作用在于其生成速度大于其降解速度：一方面TGF-β1可通过Smad3依赖性机制诱导Smad7的合成，合成的Smad7通过竞争方式与Ⅰ型受体结合以及与Smad泛素化调节因子(SMURF2)结合形成E3泛素连接酶，降解活化的I型受体，从而拮抗R-Smads介导的肾脏纤维化；另一方面，Smad3蛋白的活化诱导E3连接酶(SMURF2和Arkidia)的生成，E3连接酶能够结合泛素蛋白酶体并通过该途径降解Smad7。

2.3 TGF-β1/Smads信号通路相关miRNA与肾脏纤维化 miRNA是一类由18～22个核苷酸组成的内源性短链非编码RNA分子。近年研究者陆续在肾脏病理学中鉴定出数种与TGF-β1/Smads信号通路相关且影响肾纤维化进展的miRNA。其中，miRNA 146A、miRNA let-7、miRNA 324-3p在抗肾脏纤维化中起关键作用；miRNA 21、miRNA 433、miRNA 132、miRNA 212、miRNA 324-3p、miRNA 382发挥促肾脏纤维化作用；miRNA 29、miRNA 192、miRNA 200对纤维化的调节目前存在争议。研究[30]表明，在糖尿病肾病中，恢复miRNA let-7水平可保护肾脏。McClelland等[31]发现，miR-21可通过增加Smad3磷酸化、降低Smad7的表达促进纤维化基因的表达。Kato等[32]利用外源重组TGF-β1处理小鼠肾脏系膜细胞后，发现miR-192通过对转录因子ZEB1/2的抑制可升高TGF-β1的水平；相反，Krupa等[33]通过对糖尿病肾病患者的肾组织标本的研究发现，肾小管间质纤维化严重程度与miR-192表达呈负相关，且miR-192表达的丧失呈TGF-β依赖性。miR-192对肾脏纤维化表现出相反作用，可能是因为系膜细胞和肾小管上皮细胞miRNA表达谱对TGF-β的反应不同，因此对其潜在机制的研究可能是进一步需要探索的领域。

2.4 TGF-β1/Smads信号通路相关长链非编码RNA(lncRNA)与肾脏纤维化 lncRNA是由大于200个核苷酸组成的RNA分子，无蛋白质编码能力。近年研究表明，多种lncRNAs会破坏组织稳态，并在肾脏病理生理过程中必不可少。Zhou等[34]率先在单侧输尿管梗阻性肾病和免疫诱导的抗肾小球基底膜肾小球肾炎小鼠模型中发现，lncRNA np_5318 / np_17856可能参与TGF-β/Smad3介导的肾纤维化；Feng等[35]发现，抑制肾脏lncRNA Erbb4-IR可诱导Smad7的表达，进而可阻断TGF-β/Smad3介导的肾脏纤维化；Wang等[36]发现，lnc-TSI可通过对TGF-β/Smad3信号通路发挥负性调控作用抑制肾脏纤维化的进展。

综上所述，TGF-β1/Smads信号通路功能多样，在体内参与多种生理及病理过程，是调控肾脏纤维化的关键信号通路，但其在肾脏纤维化中的具体调控机制仍有部分尚不清楚。因此，需进一步深入明确TGF-β1/Smads信号通路调控肾脏纤维化的分子机制，为靶向治疗肾脏纤维化提供理论依据。