不同类型肺结核患者外周血维生素D与抗菌肽LL-37表达水平的研究

吴桂辉 黄涛 罗槑 蔡阳 何畏 陈蕾

维生素D是一种脂溶性维生素，具有调节钙磷代谢和调节免疫功能等多种重要作用。早在20世纪40年代，在结核分枝杆菌被发现之前，补充维生素D和(或)晒太阳曾被用于治疗结核病[1]。随后，越来越多的研究显示多种疾病与维生素D缺乏有着密切的关系[2]。维生素D的活性代谢产物——25-羟基维生素D3[25-(OH)D3]具有抑制炎症细胞因子反应的作用，通过与维生素D受体(VDR)的结合发挥调节免疫细胞的应答能力和抑制炎症因子等作用，从而抑制结核分枝杆菌的生长；同时25-(OH)D3与VDR结合后还能够产生内源性人抗菌肽LL-37，其可以增强巨噬细胞杀灭结核分枝杆菌的作用。本研究通过分析25-(OH)D3和LL-37在不同类型活动性肺结核患者及健康人群中表达水平的差异，探索活动性结核病患者新的诊疗途径。

资料和方法

一、研究对象

选择2017年6—12月成都市公共卫生临床医疗中心结核科住院的全部符合入选标准的178例活动性肺结核患者，以及本院同期进行健康体检的符合入选标准的医务人员100名(按照计划标准纳入到100名为止)。

1. 入选标准：年龄在18～60岁；汉族；居住在四川省。

2. 排除标准：有以下任意一项者即排除。(1)并发影响维生素D水平和钙、磷代谢的疾病，如甲状旁腺功能亢进、肾功能衰竭、恶性肿瘤等；(2)在纳入前30 d内患者使用过糖皮质激素；(3)目前正在使用细胞毒性类或免疫抑制剂药物，或并发自身免疫系统疾病、HIV感染等；(4)处于妊娠和哺乳期者；(5)营养不良者；(6)3个月内服用含维生素D的保健品及药品者。

3. 诊断标准：肺结核的诊断符合《WS 288—2017肺结核诊断》[3]中的诊断标准；肺外结核的诊断符合《肺结核诊断和治疗指南》[4]；糖尿病的诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2010年版)》[5]制订的诊断标准。营养不良的诊断参照《营养风险筛查NRS 2002》的标准，营养受损部分评分≥3分评定为营养不良。肺结核病情严重程度标准：病灶≥3个肺野或毁损肺，同时并发低氧血症或呼吸衰竭，临床可诊断为重症肺结核；病灶≤2个肺野，不伴有血气分析异常为轻症肺结核[6]。

4. 分组情况：符合入选及排除标准的健康对照者(A组)共计100名；肺结核患者共计178例，其中单纯肺结核患者81例(B组)，肺结核并发肺外结核患者57例(C组)，结核病(包括肺结核或肺外结核)并发糖尿病患者40例(D组)。肺结核患者以入院时病情严重程度为标准，重症肺结核患者共79例，其中单纯肺结核患者13例(16.45%)，肺结核并发肺外结核患者39例(49.37%)，结核病并发糖尿病患者27例(34.18%)；轻症肺结核患者99例，其中单纯肺结核患者68例(68.69%)，肺结核并发肺外结核患者18例(18.18%)，结核病并发糖尿病患者13例(13.13%)。

5. 一般情况：四组人群在年龄、性别等方面的比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，见表1。

6. 伦理审核：本研究方案经医院伦理审查委员会审批通过(编号：2014Y-19)，所有人群均知情同意。

二、研究方法

1. 检查方法及标准：研究对象均抽取外周静脉血3 ml，分装标本于-80 ℃保存待检。维生素D和LL-37水平均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。维生素D水平以血25-(OH)D3衡量，采用英国IDS公司25-(OH)D3检测试剂盒测定，以30 nmol/L 和50 nmol/L作为机体维生素D缺乏和充足的分界点[7]。采用美国Hycult biotech公司HK321(Human LL-37)试剂盒进行LL-37水平的测定。

表1 各组研究对象一般情况的比较

2. 检查指标：对比各组肺结核患者和健康对照者外周血25-(OH)D3、LL-37水平的差异；同时，对比病情严重程度不同的患者外周血25-(OH)D3、LL-37 水平的差异。

三、统计学处理

结 果

一、各组人群外周血25-(OH)D3及LL-37水平的比较

4个组25-(OH)D3及LL-37水平的比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表2。两两比较显示，B、C、D组外周血25-(OH)D3水平均明显低于A组，LL-37水平均明显高于A组，差异均有统计学意义(t=4.61，P=0.000；t=6.48，P=0.000；t=5.72，P=0.000和t=2.26，P=0.025；t=4.48，P=0.000；t=4.03，P=0.000)；B组血清25-(OH)D3水平均明显高于C组和D组，LL-37水平均明显低于C和D组，差异均有统计学意义(t=2.64，P=0.008；t=2.52，P=0.011和t=2.14，P=0.032；t=2.29，P=0.022)；C组和D组25-(OH)D3和LL-37水平的比较，差异均无统计学意义(t=0.30，P=0.767；t=0.49，P=0.627)。

二、不同病情患者血清25-(OH)D3和LL-37水平的比较

重症肺结核患者外周血25-(OH)D3水平明显低于轻症肺结核患者，LL-37水平明显高于轻症肺结核患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表3。

讨 论

早在20世纪40年代，人们就发现通过日光照射或补充富含鱼油的食物，可以治疗结核病。经过一系列的研究，发现维生素D能够调节机体免疫反应，具有抑制结核分枝杆菌生长的作用，阐明了维生素D缺乏与结核病易感性具有相关性[8]。

机体巨噬细胞是对抗结核分枝杆菌感染的主要力量。维生素D本身并无抗结核作用，而是其活性代谢产物25-(OH)D3通过增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的杀菌能力[9]，促进单核细胞向巨噬细胞转化，使巨噬细胞增多等，调节结核感染者的宿主免疫反应，抑制结核分枝杆菌的生长[10-11]。人体T细胞主要分为辅助性T细胞(Th)和调节性T细胞(Treg)。Th细胞包括Th1和Th2，Th1和Th2是互为抑制性的T细胞。目前认为，Th1和Th2免疫反应平衡时才有利于对结核感染的控制，无论是Th1还是Th2增多，都不利于结核分枝杆菌感染的控制，并会增加机体组织免疫损伤[12]。Prabhu等[13]发现25-(OH)D3可以抑制Th1的免疫应答，使γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)生成减少，从而减轻感染部位的炎症反应。故当机体缺乏维生素D时，其代谢产物25-(OH)D3传递信号减弱，表现出Th1优势免疫应答，引起过强免疫反应造成组织损伤。因此，25-(OH)D3在维持机体免疫应答平衡中发挥着重要作用，使机体在免疫损伤最小的情况下清除结核分枝杆菌。所以，体内25-(OH)D3水平低可能会增加罹患结核病的风险。Iftikhar等[8]报道，肺结核患者体内25-(OH)D3水平低并发肺外结核的风险更大，较高的血清25-(OH)D3水平对结核病和糖尿病均有保护作用[14]。本研究也提示肺结核并发肺外结核、结核病并发糖尿病患者体内25-(OH)D3水平均较单纯肺结核患者低。其原因除了与上述机体免疫状态低下有关，还可能与VDR的基因多态性有关[15]。体内25-(OH)D3与VDR结合形成的受体复合物可与靶基因特定DNA序列上的类固醇激素反应元件结合，从而对结构基因的表达产生调节作用，产生相应的生物学效应。

表2 各组患者外周血25-(OH)D3和LL-37水平的比较

表3 不同病情肺结核患者外周血25-(OH)D3和LL-37水平的比较

结核分枝杆菌感染人群后，约有5%～10%的被感染者可发展为活动性结核病患者，其中1%～3%会发展为重症结核病[16]。机体免疫功能受损是病情进展的主要基础，维生素D通过先天免疫及获得性免疫机制影响机体免疫状态及病情发展程度。Coussens等[17]研究指出，维生素D可以对多种细胞及细胞因子发挥作用，协助消除结核病的炎症反应，控制炎症病理损伤，进而影响肺结核的发生及严重程度，从而降低患者死亡风险。我国韩骏锋和吴琦[18]的研究也提示，维生素D水平与肺结核病变严重程度存在关联，与本研究结果相似。可见，当人体内维生素D不足时，其对结核分枝杆菌的限制及人体内各种细胞因子的功能将产生不利影响，从而影响肺结核的发生及严重程度。

由此推测，对于已经罹患肺结核的维生素D缺乏患者，补充维生素D可能会促进疾病的恢复。但是事实是否如此？在迄今为止样本量最大的随机对照研究中，几内亚365例肺结核患者被随机分为两组[19]，实验组入组时及开始进行标准抗结核药物治疗第5、8 个月时分别给予2.5 mg 维生素D3，对照组给予安慰剂，试验结束后两组首要结局指标(结核病临床严重程度评分)及次要结局指标(12个月死亡率)差异均无统计学意义。而Salahuddin等[20]对259例肺结核患者接受抗结核药物治疗的同时，随机肌内注射315 mg维生素D或生理盐水(2次/月)，12 周后试验组患者体质量增加及影像学改变较对照组明显。面对上述研究结果的差异性，可能与治疗人群抗结核药物治疗方案的差异及维生素D目前尚无确切的最佳适宜补充剂量有关。

在维生素D引起机体免疫反应并与结核分枝杆菌斗争的过程中，LL-37扮演了相对重要的角色。LL-37主要是中性粒细胞和上皮细胞分泌产生的一种人抗菌肽，具有广泛的免疫活性，发挥既促炎又抗炎的效应。LL-37是以依赖维生素D的方式在体内由中性粒细胞、单核细胞和其他免疫细胞合成的，其可以抑制白细胞介素12p40(IL-12p40)的生成而促进T细胞分化，增加Th1细胞应答，调节细胞免疫。同时维生素D与其受体结合后也能够产生LL-37。正常生理情况下，人体组织、体液LL-37的浓度为2～5 μg/ml，当机体发生炎症和病原体入侵时，LL-37的浓度会增加[21]。但是LL-37是否可以协助肺结核患者的治疗，目前尚无报道。本研究结果也仅反应出肺结核患者LL-37水平较健康人群高，且与病情严重程度存在一定相关性，提示LL-37可能是一种活动性炎症性疾病的生物标记物，其是否会给机体带来免疫损伤及其具体免疫机制，目前仍不清楚。

本研究中尚未探讨民族、季节等因素对检测结果造成的影响，亦未研究维生素D与肺结核患者机体免疫的相关性，尚有许多工作需要进一步深入。目前，中国结核病的防控工作面临诸多挑战，维生素D在结核病患者免疫反应机制中的相关研究给临床工作者带来一些启发，未来需要继续深入分析维生素D在结核病患者免疫反应机制中的作用。