血管平滑肌细胞表型转化的诱导因素研究进展

胡艳红，杨静，修成奎，王雪，方靖漪，王佳丽，刘奕清，雷燕

(1 中国中医科学院医学实验中心/北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京100700；2 广东药科大学中医药研究院/广东省代谢性疾病中西医结合研究中心)

血管平滑肌细胞(VSMCs)是一种来自胚胎发育时期中胚层的多功能性间叶细胞，周围由细胞外基质包围。VSMCs是大、中动脉中膜的主要组成部分，是保持血管壁的完整性以及维持血管张力的重要因素，可调节血压、血流量。研究[1]显示，VSMCs异常增殖和迁移造成的表型转化在心脑血管疾病中起着关键作用，是动脉粥样硬化、高血压、心衰、脑梗和血管动脉瘤等疾病的重要病理过程之一。选择适宜的诱导因素是探讨VSMCs表型转化的分子机制、研发相关血管保护作用药物的重要支撑。VSMCs表型转化的诱导因素众多，如氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、高糖、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)、晚期糖基化终末产物(AGEs)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)等，已被成功应用于建立VSMCs表型转化模型。但不同模型的分子机制和病理因素各不相同，本研究通过整理目前较常用的VSMCs表型转化诱导因素，深入探讨其分子机制，为以后靶向VSMCs的药物筛选以及具有相关抑制作用的中草药的研究和开发提供参考。

1 VSMCs表型

1989年，Baumbach等首次提出“血管重塑”，发现血管的病理生理过程不仅是血管壁形态结构的改变，还有细胞的改变如VSMCs表型转化，从此VSMCs表型转化开始进入人们的视野[2]。与骨骼肌和心肌细胞不同，VSMCs是一种非终末分化的高度特异性细胞，其表型具有可调控性，通过分化或去分化可实现表型和功能的转化。根据VSMCs形态、功能及细胞标志蛋白的不同，VSMCs表型分为收缩表型(又叫分化表型)和合成表型(又叫去分化表型)两种。生理状态下，VSMCs处于分化程度较高的收缩表型，当血管内膜受损或VSMCs受到生长因子、机械作用、血管活性物质等因素刺激时，VSMCs从收缩表型转化为分化程度较低的合成表型，这一转化过程被称之为表型转化。VSMCs表型转化的过程十分复杂，机制尚未完全阐明清楚，现大量证据表明其受多条信号转导通路的调节，如MAPK、PI3K/AKT、TGFβ/Smad、RhoA/Rock、Raf/MEK/ERK1/2以及cAMP/PKA通路等等。

1.1 收缩表型VSMCs 正常情况下，VSMCs分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的收缩表型，处于终末分化阶段，是一种稳定性表现。收缩表型VSMCs增殖、迁移活性较低，是保持血管的完整性及维持血管张力的重要因素，多出现在胚胎初期和正处于生长发育的器官。收缩表型VSMCs处于高分化状态，一般呈纺锤形，长度变异较大，其胞质内含有丰富的肌纤维，并可见致密体及致密斑，粗面内质网、高尔基体和线粒体等细胞器较少，仅产生极微量的细胞外基质，胞膜外环绕一层基底膜。收缩表型VSMCs有一些特异性标志物，如平滑肌22α(SM22α)[3]、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)[4]、调宁蛋白1(CNN1)、平滑肌特异性蛋白(smoothelin)以及钙调素结合蛋白(caldesmon)等。血清应答因子(SRF)是VSMCs收缩表型的主要调节因子，与MyoC、MRTF转录共激活因子一起负责维持VSMCs的收缩表型。此外，小G蛋白超家族的亚家族成员如RhoA，可增加MRTF的肌动蛋白依赖性核转位，在调节VSMCs收缩表型中也发挥重要作用。

1.2 合成表型VSMCs 分化成熟后的VSMCs在血流动力学变化、血管活性物质改变、炎性介质和细胞因子等刺激下可以去分化，成为分化程度低的合成表型[5]。合成表型VSMCs形态上类似成纤维细胞，呈扁平形，主要表现为细胞体积增大、肌丝含量少、结构蛋白少、收缩功能明显减弱，粗面内质网、高尔基体及游离核蛋白体等细胞器增多，并获得异常增殖[6]、迁移[7]、凋亡的能力。合成表型VSMCs大量合成和分泌细胞外基质如基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)等活性物质，促使内皮细胞功能失调，诱导血管炎性改变，可导致血管壁增厚、管腔狭窄、血管重构、血管老化，进而引起终末器官血流灌注不足、功能异常甚至衰竭[8，9]。合成表型VSMCs主要位于胚胎中期血管或病理血管中，可表达一些成骨分化的标记物，如骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Runt-相关转录因子-2(Runx2)、msh同源异型盒基因2(MSX-2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨保护素(OPG)、基质Gla蛋白(MGP)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、成骨特异性转录因子(Osterix)、上皮调节蛋白(epiregulin)以及骨钙素(OCN)等[10～12]。

2 VSMCs表型转化的诱导因素

2.1 ox-LDL ox-LDL是血浆中低密度脂蛋白被氧化后的产物。当细胞内活性氧(ROS)水平升高，或者在二价过渡金属阳离子存在的情况下，均会发生低密度脂蛋白(LDL)氧化。ox-LDL可损伤血管内皮细胞，增加多种细胞黏附分子的表达，促进单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞的黏附、迁移和浸润。研究[13]发现，ox-LDL通过清道夫受体被单核细胞等大量吞噬转化成泡沫细胞，可增加斑块粥样脂质含量，从而提高斑块的不稳定性；ox-LDL还可提高VSMCs内ROS的水平，降低超氧化物歧化酶(SOD)活性，刺激VSMCs增殖及向内膜迁移，促进细胞成骨样分化和钙化，从而干扰其表型，是导致动脉粥样硬化等多种心脑血管疾病发生的重要因素。研究[14]显示，ox-LDL可以浓度依赖性方式增加核心结合因子a1(CBFA1)mRNA表达，降低SM22α mRNA表达，增加茜素红S染色，促进VSMCs的钙化，加速VSMCs表型转化；可通过增加骨相关蛋白mRNA表达，降低VSMCs中收缩蛋白的表达，刺激NK-κB p65的核转位，促进VSMCs表型转化；ox-LDL还可使MMP-2和MMP-9合成增加，上调pERK1/2表达，促使VSMCs迁移并向合成表型转化；ox-LDL可通过调节Wnt/β-连环蛋白信号传导途径，降低miR-148b表达，干扰其表型[15]；ox-LDL可通过干扰细胞周期，增加S期VSMCs百分比，降低G1和G2期细胞百分比，下调Wnt、β-连环蛋白和细胞周期蛋白D1的蛋白表达水平，促进VSMCs增殖和迁移，诱导VSMCs发生表型转化[16]。最近，也有研究[17]发现，p38、ERK1/2/MAPK和核因子κB(NF-κB)等信号通路的激活，也影响细胞周期，还可调节增殖细胞核抗原(PCNA)和血红素加氧酶-1(HO-1)的表达，参与ox-LDL诱导的VSMCs表型转化的发生。

2.2 高糖 在糖尿病患者中，长期高糖血症是导致心脑血管并发症发生、危害人体健康的重要因素，其中VSMCs表型转化是糖尿病心脑血管并发症的重要细胞生物学基础。长期高血糖除可引起内皮损伤、血小板黏附，导致血栓形成外，受损处也可聚集大量炎性细胞，从而释放大量炎性因子，刺激VSMCs出现异质性变化，发生增殖、迁移、表型转化与分泌性改变，合成释放大量细胞基质，促使血管功能失调与血管炎性改变，最终可导致动脉粥样硬化等血管性疾病的发生。VSMCs表型转化的机理非常复杂，多种生长因子和细胞因子以旁分泌/自分泌的方式参与了此过程，促进VSMCs增殖，进一步促进VSMCs表型由收缩表型转为合成表型，形成一个复杂的因子网络。高糖可通过多种信号转导系统，影响VSMCs的功能，诱导VSMCs表型转化。比如激活PKC、STAT3/Pim-1信号通路[18]；促使p38MAPK/JNK ERK磷酸化，提高SOD和丙二醛(MDA)水平，促使ROS大量产生，引起VSMCs过度增殖和迁移[19]；诱导转运蛋白(TSPO)高表达，加速VSMCs增殖和迁移，干扰细胞表型；通过促使多功能蛋白聚糖(VCAN)大量产生，调节线粒体膜电位或线粒体功能，也可显著增加乳酸脱氢酶(LDH)活性以及MDA含量，刺激VSMCs氧化应激[20]，导致VSMCs表型转化，加速血管钙化、衰老；激活ROCK1通路，促使miR-145表达逐渐减少，增殖、迁移逐渐增多，干扰VSMCs表型分化；增加瞬时受体电位M7(TRPM7)蛋白表达和TRPM7全细胞电流，并通过活性氧-TRPM7-ERK1/2轴影响VSMCs分化标志物如α-SMA、SM22α和OPN的蛋白表达；和牙龈卟啉单胞菌一起作用于人主动脉血管平滑肌细胞(HASMCs)[21]，可上调由toll样受体4和ERK1/2-p38信号传导介导的骨形成蛋白-4(BMP4)的表达，继而通过自分泌作用继续上调骨形成蛋白-4(BMP4)特异性下游smad1/5/8-runx2信号传导，增加骨相关基质蛋白的表达，促使HASMCs表型转化，加速血管钙化；激活通路如Ras/Raf/MEK/MAPK、NADPH氧化酶途径[22]介导ROS产生。相较于持续性高糖，波动性高糖更能增强MMP-2活性、OPN的表达，干预细胞周期，对caspase-3等凋亡蛋白加以调控，促进VSMCs不断增殖，逐渐诱导其进入表型转化状态。

2.3 Ang Ⅱ Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素-醛固酮系统中的主要活性物质，生理条件下可以维持血管管壁紧张度来稳定血压，也可以刺激醛固酮的合成和分泌，维持水电质平衡和内环境稳态，但Ang Ⅱ的异常增高参与了高血压、动脉粥样硬化、血管纤维化、血管狭窄等的病理进程，Ang Ⅱ可以诱导血管平滑肌细胞的炎症、迁移、增殖、细胞外基质合成，使细胞从收缩型转变为合成型。Ang Ⅱ与Ang Ⅱ 1型受体(AT1R)结合后，可进一步激活下游通路如Wnt4/DVL-1/β-catenin导致VSMCs表型发生改变，从而促进VSMCs的增殖、分泌及迁移活性。Ang Ⅱ还可作为一种生长因子，降低抑制蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)的mRNA和蛋白水平，诱导其他促炎性细胞因子如IL-6和IL-1β的表达，为Ang Ⅱ介导的VSMCs表型转化提供了一种新机制。Ang Ⅱ通过多种途径诱导VSMCs表型转化：通过AT1R/RhoA/Rho激酶依赖性机制，增加Beclin-1、Vps34、Atg-12-Atg5、Atg4和Atg7蛋白水平，减少α-SMA表达[23]；激活RhoA/ROCK通路，诱导F-肌动蛋白细胞骨架重塑[24]；通过Ca2+内流介导的Pyk2-ERK1/2-Elk-1途径，提高TRPM7的表达，降低收缩标志物SM22α的表达，诱导VSMCs表型转化；激活JAK/STAT3通路，通过干扰细胞周期，促进增殖和迁移；通过增加线粒体氧化应激介导线粒体功能障碍，刺激酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(Nox1)激活，最终导致VSMCs表型转化，加速细胞衰老；通过调节Rac1激活和Nox1表达促进二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)的激活，也可诱导ROS的产生，从而激活MAPK(Erk1/2、p38和Jnk)途径，干扰血管表型。

2.4 AGEs AGEs是指多种大分子(蛋白质、脂肪酸或核酸等)经非酶性糖基化反应，自发地与还原单糖作用形成稳定且不可逆的非均质分子复合物，是过量的糖和蛋白质结合的产物。生理状态下，人体内AGEs的表达量很低，而糖尿病患者由于机体长期处于高血糖状态，促使非酶性糖基化反应加快，导致AGEs的生成异常增多，现已成为诱导VSMCs表型转化、加速血管老化的重要因素。晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是一种介于细胞膜与细胞质之间的跨膜蛋白。已有研究[25]证实，AGEs可以通过配体-受体结合方式结合细胞膜上的RAGE，激活下游wnt/β-catenin、NF-κB、cdc42/rac、JAK/Stat、ERK1/2和p38 MAPK信号通路，诱导氧化应激，促使VSMCs增殖、迁移，干扰VSMCs的收缩表型，是研究糖尿病相关血管性疾病的重要机制。AGEs作用于VSMCs，可上调细胞表面NOX1、NOX4、p22phox、p67phox、LRP1、CD36、RAGE等的表达，诱导细胞促氧化和炎性产生，促使VSMCs增殖；通过HIF-1α/PDK4途径，可促使碱性磷酸酶(ALP)和RUNX2活性增强，诱导VSMCs表型转化，是改变VSMCs中葡萄糖代谢的新机制。

2.5 TNF-α 血管中的内皮细胞受损时，可释放大量的炎性因子，引起VSMCs增殖、迁移，诱导表型转化，最终形成动脉粥样硬化。其中TNF-α作为一种重要的前炎性细胞因子，主要由巨噬细胞产生，由细胞表面模式识别分子受体(如Toll样受体)结合模式识别分子(如LPS)介导产生，能活化中性粒细胞和单核细胞，从而促进血管内皮细胞表达黏附分子、炎症递质等多种生物学活性。TNF-α与VSMCs表面上的受体相结合可刺激血小板源性生长因子(PDGF)分泌，促使VSMCs增生导致内膜增生。TNF-α可提高VSMCs中VCAM-1表达以及单核细胞黏附，刺激MAPK磷酸化和NK-κB活化，增加IL-6和IL-8水平，导致VSMCs表型转化和血管炎症，加速动脉粥样硬化[26]。TNF-α可通过NF-κB介导的Syndecan-4的基因和蛋白表达，激活syndecan-4/FGF-2/TGFβ信号轴促进VSMCs增殖、迁移，加速其表型转化。TNF-α刺激VSMCs可显著增强Krüppel样因子5(KLF5)启动子的活性以及mRNA水平，并下调SM22α和α-SMA的表达，而KLF5过表达可减弱SM22α和α-SMA的下调，提示TNF-α依赖的KLF5诱导可能在VSMCs的表型调节中起重要作用。此外，TNF-α可通过激活p44/42 MAPK诱导VSMCs增殖、迁移；激活PI3Kγ/p-Akt通路，下调VSMCs收缩基因的表达；还可以通过影响血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)、ERK1/2和Akt磷酸化，诱导VSMCs向胶原蛋白迁移，加速血管损伤。

2.6 PDGF-BB PDGF是由Ross于1973年在血小板α颗粒中发现并纯化出来，是血管损伤处的巨噬细胞和血小板等释放的强效细胞因子，是一种重要的促分裂剂[27]。PDGF是由A、B链聚合而成3种构型的二聚体，即PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB，起到强有丝分裂原和化学趋化剂的作用，使VSMCs、成纤维细胞、胶质细胞和巨噬细胞表达高亲和性受体。其中，PDGF-BB在正常血管中无表达，但在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等引起内皮细胞损伤后则明显上调，对干扰VSMCs表型转化、血管重构起着非常重要的作用。研究[28]发现，PDGF-BB可从多种途径诱导VSMCs表型转化，如产生大量ROS，促使ERK1/2、蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)或JAK2ERK磷酸化增加，使G1期细胞周期停滞，降低SM22α、α-SMA的表达，上调OPN表达，导致F-肌动蛋白的结构紊乱、不规则，诱导VSMCs表型转化。PDGF-BB还可刺激LncRNA CRNDE高表达，下调SM-MHC和α-actin蛋白表达，促使VSMCs增殖和迁移，以干扰VSMCs表型转化。研究[29]显示，PDGF-BB可诱导miR-26a表达显著增加，靶向Smad1通过BMP/TGF-β途径，调节VSMCs表型分化标志物基因如α-SMA、SM-MHC和钙调蛋白的表达。研究[30]显示，PDGF-BB可显著下调miR-320的表达，通过靶向NRP1调节VSMCs的增殖和迁移。研究[31]表明，PDGF-BB可通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、MMP-9、细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E下调p27KIP1蛋白表达，刺激VSMCs增殖和迁移，还可诱导黏着斑激酶(FAK)和Src激酶的磷酸化，促使氧化应激的发生，导致线粒体功能障碍，扰乱VSMCs表型。最新研究[32]发现，miR-1181在大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)中可被PDGF-BB显著下调，通过靶向信号转导与转录激活因子(STAT3)影响细胞周期从G0/G1向S期的转变，诱导PASMC的过度增殖，是导致肺动脉高压发生和发展的关键因素。

综上所述，VSMCs表型转化是一个受多种因素调控的复杂过程，ox-LDL、高糖、Ang Ⅱ、AGEs、TNF-α、PDGF-BB等因素可诱导VSMCs表型转化。VSMCs表型转化的机制十分复杂，各种信号通路相互交叉，但目前对其研究尚不是十分明确，且整体动物实验方面缺乏相应的研究数据。中药在心脑血管疾病的防治取得一定疗效，如中药复方益气活血汤、补阳还五汤、麝香保心丸，单味中药黄芪、当归、红花、郁金，中药有效组分大豆异黄酮、粉防己碱、甲基莲心碱、绞股蓝总苷、吴茱萸次碱等在抑制VSMCs表型转化方面已得到国内学者越来越多的认识及深入研究。但中药也由于其成分复杂及不良反应，致使作用机制难以明确，质量难以控制，限制了其在临床上的大量推广。这就要求我们要加大对VSMCs表型转化诱导因素的探索，从而加强中药在治疗心脑血管疾病动物模型上的相关研究深度，填补体内或临床试验空白。从而更加准确地研发相关的候选药物，最终为心脑血管系统疾病提供新的治疗手段。