运用生物信息学方法研究四逆汤作用机制的研究进展*

宋 曦,陈 晶,梁丽英,陈 炜

广西中医药大学第一附属医院(南宁530023)

四逆汤是汉代张仲景《伤寒论》中所载经方，它由附子、干姜、甘草组成，是治疗少阴阳虚阴寒证的主方，具有温中祛寒、回阳救逆的功效。四逆汤集中体现了中医扶阳抑阴、扶正祛邪的治则思想，也因其用药精炼、效验卓著，受到历代众多医家的推崇继而成为千古名方。

现代临床中，四逆汤应用广泛。其中，四逆汤运用于心血管系统疾病效果良好，如运用于心肌梗死可保护心肌细胞，治疗心力衰竭可提高心肌收缩力，因此尤为引人瞩目[1-3]。除此以外，四逆汤还有广泛的临床应用，包括治疗急性肝衰竭[4-5]、抗肿瘤[6-7]、抗休克[8-9]等。经过研究者的不懈努力，四逆汤的药理作用及其作用机制的相关成果颇为丰富，但这些研究成果仍面临着较大的挑战。

首先，四逆汤中的君药附子富含乌头生物碱，具有心脏毒性，其治疗量和中毒量较为接近。中药组方理论认为四逆汤中的甘草具有解毒增效的作用，但其配伍的科学性及甘草的解毒机制需要现代药理学的进一步的揭示。其次以四逆汤为代表的中药组方方剂，具有多成分、多作用靶点的特点，但就目前的药物作用机制研究结果而言，多数限定于一些信号通路中信号因子的改变，难于在整体上全面的反应四逆汤多成分多作用靶点的特点。在此背景下，对四逆汤这种多成分的组方药物进行以网络药理学为代表的生物信息学的研究分析，成为研究者深入研究中药组方作用机制的重要策略。以下笔者就近年来关于四逆汤运用网络药理学等生物信息分析方法进行分析研究的结果，进行一番综述。

1通过血清代谢组学结合多元统计分析揭示四逆汤的量效关系及其作用机制四逆汤多年来用于治疗心血管疾病[10]。四逆汤组方中的附子富含乌头生物碱，是附子的主要活性成分，因其毒性作用与治疗作用接近，故而治疗区间狭窄。但就四逆汤的组方而言，富含乌头生物碱的附子实乃君药，必不可少[11]。且研究也表明，四逆汤保护心肌细胞的作用也有赖于附子的存在[12]。在此情况下，评估四逆汤治疗心血管疾病的量效关系就变得迫切而重要了。

为了确定四逆汤的量效关系，Zhou等[13]使用去甲肾上腺素造成SD大鼠心肌梗死模型，后分别给予成模动物高、中、低(四逆汤浓度分别是4.0 g/ml、2.0 g/ml、1.0 g/ml)三个浓度的四逆汤胃饲。动物模型药物干预完毕后分别收集动物模型的外周血清。对动物模型的外周血清进行四极杆飞行时间质谱联用超高效液相色谱(Ultraperformance liquid chromatography coupled to quadrupole-time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)。并对因此获得的代谢组学数据进行包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、偏最小二乘法判别分析(Partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)在内的多元统计分析。结果表明，高剂量组的代谢组学数据更接近于模型组，中剂量组和低剂量组代谢组学数据彼此接近，但低剂量组与正常对照组的代谢组学数据更相近。

随后对代谢组学数据中确认的潜在生物标记的水平进行方差分析，获得15个有统计意义的潜在生物标记物。这些潜在生物标记物分别参与氨基酸代谢、葡萄糖代谢、脂质代谢和胆汁酸代谢。其中一些代谢过程已被证实参与了四逆汤保护心肌细胞的过程[14]，但有5类胆汁酸尚属首次报道，揭示了四逆汤的量效关系，并初步揭示四逆汤治疗去甲肾上腺素诱导的心肌梗死的作用机制。

2基于代谢组学和网络药理学方法研究四逆汤的药物作用机制迄今为止，药学的研究模式已经从以往的单一药物作用于单一蛋白因子水平，发展至药物同时作用于多个蛋白标靶[15-16]。这种研究模式转变的背景是因为研究者越来越多的认识到，多种疾病其实是在多因素共同作用下产生的。这样的研究模式的转变，一方面促使研究者们寻找更多的切合实际的研究、分析方法。另一方面，也引导研究者将目光聚焦于中国传统医学(Traditional Chinese Medicine,TCM)，其内在原因就在于中国传统医学的主要用药是多种药物组成的复方方剂，中国传统医学的诊疗理论着眼于整体的“阴阳平衡”。

在此背景下，以四逆汤为代表的中药组方方剂理所应当的成为人们研究的对象。Chen等首先就四逆汤及其汤剂中的主要活性成分建立化学结构数据库，并对其进行详细的成分注释。随后使用阿霉素诱导产生心肌损伤小鼠模型，心肌损伤小鼠模型成模后进行分组，在给予不同的药物干预，药物包括四逆汤、四逆汤三个组成药物的活性成分别组合成的方剂、三种药物的活性成分的单剂。药物干预完毕，对各组小鼠的心肌组织处理后进行气相/液相色谱质谱分析，所获代谢组数据进行多元统计分析。结合该研究团队前期的研究结果，Chen等获得了四逆汤中186种活性成分，及39种四逆汤的蛋白靶标。随后，对这些药物活性成分和蛋白靶标进行分子链接和网络药理学分析，最终获得四逆汤活性成分与蛋白靶标之间的网络关系图。四逆汤的这些蛋白靶标分布于氨基酸代谢、脂质代谢等生物过程，且这些蛋白靶标中已有部分被其他研究者证实参与了四逆汤保护心肌的过程[17]。这个研究结果一方面验证了四逆汤可保护阿霉素诱导的心肌损伤，更重要的是通过网络药理学和代谢组学的结合运用，深入探讨了四逆汤保护阿霉素诱导心肌损伤的作用机制，证明了四逆汤组方的科学性可必要性。

运用类似的思路，Chen[18]等对四逆汤的化学组学、血清药物化学和外源生物代谢组学数据进行了类似的分析研究，从不同侧面完善四逆汤药物作用机制的研究。以血清药物化学分析为例，研究者通过血清药物化学分析获得了四逆汤的48个有效活性成分，接着使用网络药理学分析方法获得这48个有效活性成分的61个潜在蛋白靶标。再使用生物过程和信号通路富集分析(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)获得这61个潜在蛋白靶标所在的10个生物过程，最终得到四逆汤保护心肌细胞的作用机理[18]。

以上的研究结果表明：网络药理学分析成功的关键在于药物活性成分对于特定疾病有清晰的药物作用，此外也需要对特定疾病的生物靶标有较为深入且全面的了解。在此基础上，通过网络药理学分析，就可将药物活性成分与疾病的生物靶标链接起来，进而分析药物治疗该疾病的作用机制。与四逆汤相关的药物作用机制研究已进行多年，累积了大量的研究数据，这也是进一步进行网络药理学分析的基础。

3通过数据挖掘和生物信息学分析研究四逆汤的“效-毒网络”四逆汤作用机制研究的深入，为数据挖掘和生物信息学分析提供了丰富且可靠的数据来源。李志勇等[19]首先从TCM-GeneDIT数据库中进行数据挖掘，获得与四逆汤中三个成分(附子、干姜、甘草)相互关联的基因信息。随后针对这些关联基因在Pubmed中进一步进行数据挖掘，获得确定的基因相互关系，并构建附子、干姜、甘草相互关系的基因生物网络。接着，使用类似方法进行附子“效-毒网络”的构建。最后通过筛选共享基因和通路预测的方法，分别预测干姜、甘草调控附子“效-毒网络”的通路。最终李志勇等认为，干姜和甘草可能通过影响免疫-炎症反应信号通路、细胞凋亡-自噬信号通路、神经细胞与心肌细胞缺血缺氧保护信号通路等途径发挥拮抗附子毒性的作用。尽管这些结果仍需要进一步的实验验证，但数据挖掘和生物信息学分析无疑为今后四逆汤的作用机制和毒副作用的研究预测了方向。

吴德坤等[20]则通过文献检索的方法，收集四逆汤干预心肌梗死的代谢组学实验研究，对这些文献中提及的纳入研究的已被证实的代谢产物进行汇总，采用KEGG等生物信息学分析方法，获得四逆汤干预心肌梗死的代谢产物谱及代谢通路。这些代谢通路同样涵盖了糖、蛋白质的最终代谢通路，如三羧酸循环、氨基酸合成等。研究人员因此认为代谢组学可作为揭示代谢通路的工具，通过选择适当的生物信息学分析方法，对中医药的作用机制进行预测和发现。

4总 结多年来，中国传统医学的组方方剂处境尴尬，一方面两千年的实践经验证明其有效性，另一方面研究者们缺乏有效的研究方法和技术手段对其疗效和作用机制进行全面的揭示。以四逆汤为例，其回阳救逆的疗效显著，是著名的经方，直至当下，其临床应用堪称广泛。但四逆汤的主要药物附子富含乌头生物碱，又被证明具有明确的毒副作用，因此不免为人诟病。

网络药理学于2008年提出[15]，主要用于寻找药物有效成分与靶标蛋白之间的联系。而代谢组学研究则对于追溯药物的作用机制有着重要作用，它可以全面展示药物作用后各器官整体的状态。代谢组学研究的兴起，与中国传统医学的系统性和完整性有着内在的契合。将网络药理学和代谢组学结合，是目前研究中药组方作用机制的有效策略。随着这方面研究的进一步拓展，中药组方的科学性、毒副作用将会得到更加清晰的阐述，也将会使得以四逆汤为代表的中药组方方剂在临床的应用更加合理。