生物安全对实验室检测非洲猪瘟病毒的重要性

张雪梅 祁俊娟 王丹怡 王艳红 詹颖洁 唐艳荣

（北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

自2018年8月3日，经中国动物卫生与流行病学中心诊断并确诊沈阳市沈北新区沈北街道（新城子）发生我国第一例非洲猪瘟疫情。至2019年3月22日全国共有28个省发生疫情，非洲猪瘟疫情已经波及到多家上市公司，造成巨大经济损失，严重影响了生猪养殖业健康发展，也对生猪产品质量安全和有效供给构成威胁。中国非洲猪瘟疫情防控形势已十分严峻。

非洲猪瘟病毒（ASFV）是一种独特的双链DNA病毒，它是目前唯一的DNA虫媒病毒。非洲猪瘟不是人畜共患病，不会感染人，同时它也不会感染猪之外的其他动物，不影响食品安全。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。主要症状：自然感染潜伏期很短，发病时体温升高至41℃，约持续4d，直到死前48h，体温开始下降，同时临床症状才显示出来，猪只食欲减退，显出极度需弱，呼吸困难，浆液或粘液结膜炎，有时会引起带血性下痢，呕吐，死亡。

主要病理变化：在耳、鼻、腋下、鹛腹、会阴、尾、脚无毛部分呈界线明显的紫色斑。在淋巴节有猪瘟罕见的某种程度之出血现象；脾脏肿大，有些肿大可至10倍，质脆；循环系统：心包液特别多，多数呈现心包下及次心内膜充血；呼吸系统：喉、会厌有瘀斑充血及扩散性出血，镜检常有充血而没有出血病灶，肺泡则呈现出血现象，淋巴球呈破裂。

我国的非洲猪瘟疫情由国外传入。国内疫情传播主要通过生猪及其产品跨区域调运、餐厨剩余物喂猪、人员与车辆带毒传播这三种途径。由于在世界范围内到目前为止没有研发出可以有效预防非洲猪瘟的疫苗，猪一旦感染死亡率为100%，给我国疫病防控带来非常大的安全隐患。所以及时发现疫情变得尤为重要。由于非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。

目前，实验室检测非洲猪瘟的方法主要有聚合酶链反应（PCR）、红细胞吸附试验、酶联免疫吸附试验。我实验室主要采用实时荧光PCR方法对非洲猪瘟进行检测。实时荧光PCR是最广泛应用的病毒学诊断技术，敏感度高、特异性强、能够实现ASFV核酸的快速检测。此法容易发生交叉污染，应该采取适当的预防措施来减少和控制污染风险的发生。

非洲猪瘟病毒对温度和pH的抵抗力较强，在低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，加热被病毒感染的血液55℃30分钟或60℃10分钟病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。

针对ASFV特点及PCR诊断技术的特点，做好实验室生物安全尤为重要。下面从几方面谈一下实验室生物安全。

第一、实验室设计，PCR实验要求在生物安全二级（BSLII）及以上实验室来完成。实验室选址、设计和建造应符合国家和地方环境保护和建设主管部门等的规定和要求。实验室内部必须分区，避免交叉污染，实验室的走廊和通道应不妨碍人员和物品通过。

第二、实验室的设计应保证对生物、化学、辐射和物理等危险源的防护水平控制在经过评估的可接受程度，防止危害环境。实验室的建筑材料和设备等应符合国家相关部门对该类产品生产、销售和使用的规定和要求。

第三、应有专门设计以确保存储、转运、收集、处理和处置危险物料的安全。应清楚地标示出具体的危险材料、危险，包括：生物危险、有毒有害、腐蚀性、辐射、刺伤、电击、易燃、易爆、高温、低温、强光、振动、噪声、动物咬伤、砸伤等；需要时，应同时提示必要的防护措施。

（1）实验室应标示危险区、警示区，包括用于特殊情况下的临时标识，如“污染”、“消毒中”、“设备检修”等。在某些情况下，宜同时使用标识和物理屏障标示出危险区。

（2）标识应明确、醒目和易区分。只要可行，应使用国际、国家规定的通用标识。

（3）实验室入口处应有标识，明确说明生物防护级别、操作的致病性生物因子、实验室负责人姓名、紧急联络方式和国际通用的生物危险符号；实验室所有房间的出口和紧急撤离路线应有在无照明的情况下也可清楚识别的标识；所有管道和线路应有明确、醒目和易区分的标识；在须验证或校准的实验室设备的明显位置注明设备的可用状态、验证周期、下次验证或校准的时间等信息。

（4）所有操作开关应有明确的功能指示标识，必要时，还应采取防止误操作或恶意操作的措施。

实验室的生物安全管理

第一、建立质量与生物安全管理体系：设立生物安全委员会，要建立生物安全监督员和内审员队伍，定期进行生物安全督促检查；要求各部门执行本单位编制的实验室质量与生物安全管理体系文件，并按文件规定的程序开展各项管理活动。实验室管理层应负责安全管理体系的设计、实施、维持和改进，实验室安全管理体系应与实验室规模、实验室活动的复杂程度和风险相适应。

第二、人员管理：实验室生物安全工作的关键是人，人员要紧绷生物安全这根弦，保证所有实验人员持证上岗，所有实验人员经常进行专业和管理培训，以达到增强生物安全防范意识的目的。工作中必须做好人员防护。抓好实验室生物安全人才队伍建设。

第三、菌（毒）种和阳性样本的管理：严格按照国家相关规定由熟悉相关的生物安全知识的人员实行双人双锁管理制度。

第四、环境与设备管理：按《实验室生物安全通用要求》对实验室生物安全实行分级管理。制定相应的操作规程并合理使用。重点提到是生物安全柜、无菌操作台、高压灭菌器的科学使用，锐器的使用和存放也应合乎要求，消防器具不但在品种上要满足实验室的特殊要求，而且要在保质期内使用。

第五、废弃物安全管理是防止生物安全事件的重要一环。病原微生物实验室的培养物、储存物、垃圾以及其他废弃物的处理和处置必须以安全为目的，要制定消毒制度，储备消毒剂，而且要确保消毒剂的有效性并对消毒效果进行判定。

第六、检测不同的实验要按不同的等级做好个人防护，建立应急预案。

第七、实验室一天内必做事情：早起第一件事就是给实验室通风；开启实验室必备的仪器；检查实验室的卫生情况，及时处理垃圾，保持干净整洁；检查实验室各种仪器的安全，尤其是电源插口处，是否有松动，及时插紧；实验室的危险仪器的使用，必须做到仪器在人在，以防出现事故及时处理；晚上离开实验室，切断一些仪器的电源，并关好门窗，带走废弃物。

病原微生物实验室的安全性取决于实验人员的安全意识，实验室设施的建设，防护设备的配置和管理体系的完善，才能保证生物安全。只有在保证生物安全的基础上，对非洲猪瘟病毒的实验室检测才能确保真实有效，对非洲猪瘟疫情才能做到及时发现，提早控制，防止疫情的进一步扩散。