非病毒载体介导的基因治疗在骨缺损修复中的研究进展

任超 周诺

广西医科大学附属口腔医院，广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西颅颌面畸形临床医学研究中心，颌面外科疾病诊治研究重点实验室（南宁530021）

随着社会经济发展，由各种先天性、感染、创伤、恶性肿瘤和骨折引起的骨畸形和骨缺损的数量在逐年增加。骨组织有一种独特的自我修复能力。然而，在一些临床病例中，人体无法再生骨导致愈合受损，临床中不能愈合的骨缺损主要由自体骨、异体骨和骨移植替代物来填补。同种异体骨移植有潜在疾病传播的风险，而临床自体骨移植治疗又有造成供体部位疼痛和缺损、手术时间过长和可供组织量有限等局限性以及骨生长因子在体内半衰期短的问题。基因治疗可能是骨缺损的替代疗法，使用基因载体将生长因子传递到骨缺损部位，靶基因可持续和潜在可调控地诱导产生的内源性骨形成蛋白较外源重组蛋白生物利用度高，内源性生长因子通过在局部的表达来促进损伤部位的修复和再生，转基因技术联合干细胞工程修复骨的缺损拥有着不可估量的应用价值和发展前景。然而目前大量的实验研究还仅局限于动物实验，因此，在转化为临床实践之前，必须开发可靠且有特异性的基因载体系统并评估其功效和安全性。基因载体可根据其来源分为两大类：病毒载体和非病毒载体。非病毒载体因其具有低免疫原性、成本低廉、制备简便、基因携带量大等优点而成为研究的热门领域［1］。本文简要回顾了非病毒载体的生物学特性及其在骨缺损修复领域体内体外实验的研究进展。

1 非病毒载体的生物学特点及发展

通常用于基因治疗的病毒载体包括经过修饰了的慢病毒、腺病毒、腺相关病毒等。由于病毒载体与野生病毒一样对体细胞易感，因此其转染效率较高，但仍存在许多难以克服的缺陷。病毒载体可携带的目的基因通常受野生型病毒基因组大小的限制，其次，病毒载体制备复杂，有较严格的储存运输要求，成本高，最重要的是安全问题，所携带的基因序列有可能重组入宿主基因组，有致癌风险以及免疫原性［2］。与病毒载体不同，非病毒载体具有优异的生物安全性，低毒性、低免疫原性、外源基因的低整合率，除此以外，携带基因的容量大，制备简单，易于保存和测试的优势使其在基因治疗领域有着巨大的应用潜能，然而，限制其被广泛使用的最重要因素是低转染效率［1］。所有基因载体系统成功实现转染必须顺利完成核酸被递送至干细胞、细胞穿过细胞膜屏障、逃避内吞作用和溶酶体、基因与载体解离并进入核屏障四个阶段［3］。随着科学技术的发展以及对基因载体系统转运机制研究的深入，许多经过不断地优化后能够满足临床高效安全要求的非病毒载体被研制出来。目前，临床试验中常用的非病毒载体有脂质体或脂类复合物、阳离子多聚复合物、多肽蛋白类、细胞穿透肽、纳米材料递送系统等。在基因增强骨组织工程中研究应用较多的是脂质体和阳离子聚合物。

1.1 脂质体及脂质体复合物 脂质体是通过在水中疏水缔合的磷脂的有序排列的组合体，并且封闭的微胶囊由一个或多个脂质样双层膜形成，其特殊的结构使脂质体具有低毒性、优异的生物相容性、可降解性、较大的目的基因包装能力、易于制备和改性等优点，同时，当DNA 等包封到人体内时，可以防止DNA 被核酸酶降解，并且促进内体的逃逸以有效辅助基因转移［4］。FELGNER 等［5］在1987年首次使用阳离子脂质（DOTMA）作为基因转移载体。对脂质体的研究发展至今，脂质体可根据性能分为多种类型：一般脂质体、光敏脂质体、热敏脂质体、pH 敏感性脂质体和磁性脂质体等。根据电荷的性质，脂质体将分为阳离子脂质体、中性脂质体和阴离子脂质体。

阳离子脂质体是当前最常使用的非病毒基因传递载体。研究者们为改良阳离子脂质体低转染效率和靶向性的问题使用了众多方法，包括添加辅助性材料、对脂质体表面进行结构性修饰、研发设计新型脂质材料、创新制备工艺等。一些学者在脂质体表面进行了聚乙二醇（PEG）-脂质修饰，PEG 化脂质体的理化性质更稳定，降低了对单核巨噬细胞系统的识别摄取［6］。还有研究者从食品级油脂中提取的脂肪酸混合物（如棕榈烯脂）制备阳离子脂纳米载体系统（ps-lip）［7］，因为食品级的棕榈酰甘油（三酰基甘油）含有肉豆蔻酰（C14）到亚油酸（C18：2）的链长，链长变化小，组成均匀稳定，增强了对附着及悬浮细胞的转染效率，对于核酸的传递和基因编辑更有效、更经济、更安全。制备阳离子脂质体的常规方法包括反向蒸发法、钙融合法、冻融法和洗涤剂法等。近年来许多新的生产技术被研发出来以提高脂质体的转染效率，有高压均质化方法，优化的乙醇注入方法，真空干燥-超声方法，膜-冻融方法，SUV-融合方法等［8］。阳离子脂质体的转染效率不仅与阳离子脂质体的结构有关，而且与载体跟DNA 的比值密切相关。HAN 等［9］在研究非病毒转染技术中得到最佳转染效率的阳离子脂质体：DNA 用量比例为0.3 μL：80 ng。

1.2 多聚物载体 聚-L-赖氨酸（PLL）［10］是第一种用于体内基因转染的聚合物，随后许多阳离子聚合物作为体外和体内基因载体迅速发展起来，合成型阳离子聚合物包括多聚赖氨酸、聚氨酯、聚乙烯甲胺阳离子共聚物、聚磷腈类；天然生物阳离子聚合物有壳聚糖、环糊精及其衍生物。阳离子聚合物具有优异的DNA 结合和保护作用，并具有优异的生物相容性，生物安全性和易于进行化学修饰的优点使其在未来基因治疗领域有着无限的应用价值。多聚物的特点是可以利用复杂的分子结构形成独特的构象，从而大大提高载体稳定性和外源基因的缓释效果，多聚物上的多种官能基团能通过静电或共价键等方式易于被修饰而改性。

1.2.1 聚乙烯亚胺（PEI） PEI 是近年来发展最快的基因载体之一。作为化学原料，PEI使用范围广，价格低廉，来源广泛。1985年，BOUSSIF 等［11］发现PEI 具有基因转载的作用。PEI 能作为基因转染载体是由于其氨基含量较高，在生物环境下能够发生“质子海绵”效应，可让复合物从内涵体中逃逸顺利入核［12］。随后国内外众多学者对PEI 载体转运机制进一步的研究得出影响PEI 复合物转染效率的因素有PEI 的相对分子质量、表面电荷密度、PEI 的氨基与DNA 的磷酸基的比（N/P）、复合物的粒径等。王清富［13］的实验结果证实，转染效率随着N/P 值的增加而增加，获得最大转染效率的N/P 为6，为优化PEI 传递系统和研制新型载体提供理论支持。

PEI 的转染率和细胞毒性与PEI 的分子量成正比，因此在使用PEI 作为转染试剂之前，应考虑转染效率和细胞毒性的分子量和浓度之间的平衡。许多研究人员使用特殊基团修饰PEI，如双氨基甲酸酯键、惰性可降解聚合物等用于连接低分子量PEI 以通过交联或链延长获得高分子量可降解聚合物，从而达到增强其特异性和稳定性，降低毒性，提高转染效率的作用。PENG 等［14］则分别利用环糊精和壳聚糖交联小分子PEI 来提高其分子量，既能够达到一定转染效率，也保存了小分子PEI 生物毒性低的优点。HUANG 等［15］首次提出了一种超分子策略，即用大环葫芦［7］脲（CB［7］）包裹大分子量PEI（分枝，25 kDa），转染效率高，PEI 的细胞毒性被显著抑制，是一种有效的非病毒基因传递载体。该策略为降低PEI 和其他阳离子基因载体非特异性毒性提供了新的见解。近年来，有研究者打破了“效率-毒性”悖论，LIU 等［16］通过锌（Zn）对阳离子聚合物（LCPs）的协同修饰，可以同时实现高转染效率和低分子量（降低细胞毒性）。

PEI 的毒性与其较高的表面电荷密度有关，降低阳离子聚合物细胞毒性的另一种方法是添加一个亲水层来掩盖表面的正电荷，比如PEG［17］、普朗尼克［18］、葡聚糖［19］等。凭借静电力的相互作用，PEI 与DNA 形成的复合物表面电荷密度和载体的毒性均较PEI 低。有许多报道认为PEI 的内体缓冲能力与基因转移效率无关，膜分解同样具有细胞毒性，细胞质内DNA 也面临被降解等风险，故有研究者［20］构建组蛋白（H3）修饰PEI，H3 避开了溶酶体转运而是利用其效应器和Rab6 GTPase 调控的逆行通路，它极大地提高了将聚合物输送到细胞核中的效率，同时降低了细胞毒性。改进的靶向细胞核的策略对于促进基因治疗在再生医学和许多其他疾病中的发展至关重要。

1.2.2 壳聚糖（CS） CS 是一种无生物毒性多糖，是通过甲壳素的脱乙酰化形成由β-（1，4）糖苷键连接的D-葡糖胺和N-乙酰基-D-葡萄糖胺亚基组成的聚合物。在1995年MUMPER 等［21］是使用壳聚糖作为基因转移载体的第一位学者。研究发现壳聚糖和带负电荷的DNA 通过静电力形成复合颗粒，并且颗粒可以顺利地穿透细胞膜并完成基因治疗。尽管壳聚糖的转染率低，但由于其无与伦比的安全性和优异的生物相容性和生物降解性引起了广泛的关注。

影响壳聚糖的转染效率的因素包括其自身的结构如分子量、脱乙酰度、壳聚糖／DNA 复合物的氮磷比（N/P）、粒径和运输条件如pH、细胞类型等。研究证实，壳聚糖分子量越高，保护细胞外DNA 能力越强，用于高效基因转染的最佳pH 值为6.8～7.0，最佳电荷比在3～5，最佳血清浓度为10～20 wt%［22］，除此之外，中度脱乙酰的壳聚糖转染效率更高［23］。明确了壳聚糖最佳转染条件后，为其之后的优化改性提供了科学的理论基础。壳聚糖易于被改性，可以通过制备衍生物或复合其他材料以提高转染效率。许多研究人员通过增加壳聚糖的电荷密度来提高壳聚巧的转染效率，例如，通过壳聚糖末端胺的N-季铵化来增加电荷密度［24］；用PEG 修饰壳聚糖聚合物［25］；用高电荷密度PEI 接枝改性［26］等。林福星［24］创新性地使用含磷化合物，通过辐射接枝技术制备聚苯乙烯膦盐接枝壳聚糖的复合物（CS-P），基因转染效率从4.59%提高到32.8%。还有研究［27］发现3-D 矿化藻酸盐壳聚糖微胶囊是一种低毒性的，具有生物学和实用价值的非病毒基因载体，与许多其他的非病毒载体系统相比，在转染原代骨细胞中具有较高的转染效率。

2 非病毒载体在骨修复领域的研究

随着分子生物学的不断发展和骨创伤愈合机制研究的深入，通过转基因技术，利用非病毒载体介导内源性或外源性的生长因子来促进新骨形成和修复骨组织缺损已成为国内外前沿研究的热点。在促进新骨的生长重建和骨缺损的修复的复杂过程中，各种细胞及生长因子在各个阶段均起到了重要的作用，细胞因子之间相互作用，对激素的分泌以及对细胞的代谢均起到调控作用。生长因子包括转化生长因子-β（TGF-β）、骨形态发生蛋白（BMP）、酸性和碱性成纤维细胞生长因子（FGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）和血管内皮生长因子（VEGF）等［28］。

2.1 基于体外基因传递的骨再生工程 科学研究已经广泛证实了BMP-2 是诱导胚胎骨生长和成人骨修复的重要生长因子。Lip2000 是已实现商品化的非病毒载体，具有低毒、高效、操作简便、价格优廉等优点，已广泛应用于基因治疗上。方志辉等［29］利用Lip2000 成功将BMP2 基因载入大鼠的BMSCs 中，诱导其向成骨细胞分化，促进骨小梁形成并缩短了骨折愈合的时间。骨缺损修复是由多种细胞及生长因子共同参与完成的，因此许多研究者通过非病毒载体携带多基因转染干细胞实现共表达，更好的模拟了体内生理过程。一些研究人员［30］使用阳离子脂质体作为载体，体外转染干细胞实验表明，BMP2 和VEGF165 联合基因以及IGF1 和BMP2 联合基因在骨再生中均具有良好的协同效应，外源性基因均得到稳定表达，阳离子脂质体作为非病毒载体其低毒性、出色的生物相容性、较大的DNA 包装能力等出色的优点。FGF-2 和BMP-2 在PEI 递送下共转染人脂肪来源的间充质干细胞（hADMSCs）也表现协同促进成骨分化作用［31］。

研究者们为了优化阳离子脂质体的性能，许多经过结构性修饰或新研发的类脂质体较传统脂质体在体外成骨实验研究中获得了较高转染效率以及较低的细胞毒性。GAO 等［32］从［12］-aneN3 中提取阳离子脂质并分别用由萘酰亚胺（1a）、油酸（1b）和十八胺（1c）进行修饰，3 个传递系统均对成骨细胞MC3T3-E1，MG63，HeLa 和HEK293 细胞均表现出良好的转染效率，其中1a 的转染效率比lipofectamine 2000 更高，除此之外它还成功通过非侵入性荧光成像对细胞摄取，DNA 转运和释放进行原位监测。因此，笔者得出结论，1a 作为多功能非病毒传递系统，用于治疗未来成骨细胞相关的各种骨疾病可能是一个有前途的非病毒基因载体。ATTIA 的研究团队［33］以阳离子脂质体2，3-二（十四氧基）丙烷-1-胺为基础并结合聚山梨醇酯80开发了一种新的类脂质体载体系统，将BMP-7 基因转染间充质干细胞（MSCs），转染后细胞增殖活性、ALP 活性显著增强，细胞外基质沉积，证明了他们设计的非病毒载体可以有效的用传递BMP-7，促进新骨再生，为开发新的高性能基因载体提供了进一步的思路。阳离子脂质体作为基因转染的载体在体外的研究应用已趋于成熟，为今后开展体内实验研究以及骨缺损修复的临床应用奠定基础。

除此以外，还有许多新型非病毒载体经过体外实验验证，同样能高效地传递基因入靶细胞并稳定地表达蛋白。由CHEN 等［34］设计的新型非病毒基因载体PAA-BA 在转染BMSCs 后显示出成骨分化潜能的增强，这些发现表明基于PAA-BA 的基因递送载体可以维持BMSCs 的干细胞特征，PAA-BA 具有更好的细胞相容性与安全性。还有研究者38 开发了一种用聚合物pDNA 纳米复合物涂覆钛表面以增强骨整合的新方法，笔者发现，以N/P 比率为10 制备的涂有PEI-pDNA（BMP-2）纳米复合物的圆盘体外转染BMSCs后可有75%的细胞活力和14%的转染效率，与对照组相比，成骨标志物的表达较强，并有明显的钙沉积，突出了非病毒载体与基因活化的钛表面结合后具有增强骨整合的潜力。由于microRNA 在骨再生中稳定性差、细胞摄取低，低免疫原性，WU 等［35］制备了壳聚糖/三聚磷酸盐/透明质酸纳米颗粒（CTH NPs），CTH NPs 在向骨髓间充质干细胞递送抗mir-138 方面显示出高效率和无毒性，且有较强的骨再生能力。这些研究提示了非病毒载体用于基于BMSCs的基因治疗的潜能，特别是骨相关疾病，为开发新型高效基因传递系统提供了进一步的见地。

2.2 基于体内基因传递的骨再生工程 局部基因治疗具有通过将成骨基因局部递送至骨病变区持续地指导受调蛋白质表达来增强骨缺损愈合和骨再生的潜力。基因激活基质（GAM）是由质粒DNA 和可生物降解的生物材料作为载体组成的惰性支架系统，通过聚合物支架将质粒DNA转移至靶细胞，已被广泛用于组织工程学研究。GAM 具有众多优点，如低免疫原性，可以避免将载体分布到其他组织中，高生物降解潜力和易于大规模生产等。成骨基因与生物相容性支架的结合极大地加速了骨愈合。D′MELLO 等［36］开发并评估了一个新的非病毒基因递送系统的体内骨再生的能力，利用胶原支架传递聚乙烯亚胺（PEI）-质粒DNA（pDNA）复合物至大鼠颅骨缺损中，植入体内后检测新骨量/总体积（BV/TV）%非病毒PEI-pPDGF-B 复合物、PEI-pVEGF-B 复合物负载的支架明显高于空支架，其中PEI-（pPDGF-B+pVEGF）复合材料促进大鼠颅骨缺损的成骨效果最优，并显示出更高的组织再生效率和低细胞毒性及低免疫原性。基于之前大量研究证明多种细胞因子有协同成骨的作用，KHORSAND 等［37］在糖尿病兔骨干长骨径向缺损模型中植入负载有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）复合物的胶原支架，在BMP-2 和FGF-2 的协同作用下骨缺损处有大量新骨再生，因此载有PEI-（pBMP-2 + pFGF-2）的支架可能是促进糖尿病患者骨缺损修复的有效方法，具有巨大的临床应用潜力。还有研究发现载有含编码成骨蛋白的cmRNA 的非病毒载体支架的高转染效率，低细胞毒性和体内成骨潜能而被认为可能是促进骨再生的有效工具［38］。这些研究为未来临床应用非病毒基因载体治疗各种原因所致的骨缺损修复的可行性和有效性提供了理论基础。

宿主细胞的高转染效率和安全性是体内有效基因转染所必需的。许多研究者开发并评估了用于体内骨再生的组合非病毒基因载体的可行性和有效性。赵亮［26］采用共价交联法制备的CS-PEI/hBMP-2 纳米粒子在体外能有效转染MC3T3-E1 细胞并具有促进细胞增殖、诱导MC3T3-E1细胞分化的能力，将CS-PEI/hBMP-2 复合至明胶海绵支架上，植入到大鼠颅骨骨缺损处12 周后通过Micro CT 及组织学染色观察结果表明CSPEI/hBMP-2 纳米粒子能促进新骨形成，并且没有明显的体内毒性。YUE 等［39］也通过实验验证了CS-PEI/hBMP-2 具有体内外促进成骨分化的能力，促进骨组织分化，修复骨缺损。CS-PEI 在转染效率和生物安全性方面均优于PEI 和Lipofectamine，是一种很有前途的非病毒载体，在干细胞基因治疗中拥有广阔的应用前景。除此之外，nGO-PEG-PEI 因其较高的siRNA 传递效率和持续的靶基因沉默而被认为可能是一种有前途的siRNA 载体，研究者通过制备纳米级的PEG 和PEI 双功能化氧化石墨烯（GO；nGO-PEG-PEI），再通过阳极氧化法制备的二氧化钛纳米管（NTs）经阴极电沉积，用nGO-PEG-PEI/siRNA对其进行生物氧化得到NT-GPP/siRNA，NT-GPP/siCkip-1 显著改善了MC3T3-E1 细胞的体外成骨分化，增加了ALP 的产生、胶原分泌和ECM 矿化，可明显增强体内骨整合，改善了成骨相关基因表达［40］。因此笔者认为，组合非病毒基因载体应用于体内骨缺损修复是可行并且有效的，它集多种非病毒载体的特性于一身，作为一种新型非病毒载体系统，在口腔及整形外科的临床应用有很大的潜力。另有一种小核酸传递系统是由成骨细胞靶向肽（SDSSD）修饰的聚氨酯（PU）纳米微粒，它封装siRNA/microRNA，能有效将药物靶向传递给成骨细胞且在体内不会产生明显的毒性或引起免疫反应，可作为一种成骨细胞诱导的骨合成代谢病的治疗方法。

虽然国内外已有大量基因治疗的实验研究，但是迄今为止，尚未开发出在临床上能广泛应用于骨再生领域的基因载体。基于生长因子的基因治疗的主要限制是大型动物研究不足，将这些研究转化为人类临床实践仍然是一个巨大的挑战。众学者在非病毒载体介导的基因治疗在体内外成骨、修复骨缺损方面的研究结果均有积极的意义，为进一步将基因治疗的体外实验转为体内临床应用提供了有价值的信息。

3 问题与展望

随着骨再生和骨修复生物学研究的深入，基因转染的载体的性能、基因转移技术及基因治疗方法的不断优化，将基因治疗与骨组织工程相结合，利用诱导因子以持续性而可控的方式刺激内源性生长因子合成来促进骨缺损区新骨形成，基因传递比直接高剂量蛋白质递送更具成本效益，已然成为骨组织工程未来的发展方向。然而大多数实验仍局限在体外和小型动物实验阶段，除此之外，监管义务不到位，财政支持的限制，安全问题和基因传递方式的局限性也是将基因治疗纳入临床考虑的主要限制。因此，在转化为临床实践之前，开发出可靠的、可复制的基因传递方法与有效性和安全性得到保证的合适载体是我们目前共同追寻的目标，这也是未来开展基因治疗最艰巨的任务。

基因治疗是一个相对较新的医学领域，安全是首要考虑因素，在设计基因治疗的载体时笔者要考虑几个方面，尽量最小化DNA 在宿主基因组中的插入以避免突变的发生；优化传递方法以防止血液或组织中DNA 被降解；生产过程中保证载体结构的质量，将毒性降至最低。转化为临床应用时还需要考虑实际因素，例如患者的年龄、性别、系统性健康状况以及骨性疾病的性质，使基因治疗个性化。理想的基因载体还应该对靶细胞高度特异且生产、储存、运输成本适宜。

非病毒载体具有生物毒性低，免疫原性低，基因容量大，外源基因整合率低的优点，为其临床的应用提供了更多可能性，以及制备简单、便于大规模生产、使用方便、靶向性好、易于保存和检验等优点，因此具有很大的发展空间，是未来基因携带者的主导方向。但非病毒载体体内转染效率和转基因表达持续时间较病毒载体低，这将是非病毒型基因载体临床应用受到限制主要因素。相信随着基因载体复合物的细胞内转化及细胞内部转运机制的深入研究，将会有越来越多的全新的非病毒基因载体出现，非病毒载体介导的基因治疗在骨缺损修复领域将会取得更多的研究成果。