肠道紧密连接跨膜蛋白研究进展

娄文静，刘冬妍

0 引言

肠上皮是机体抵抗内源性和外源性有害物质的第一道防线，为机体与外界环境之间提供了一个选择性可渗透屏障，能够限制肠腔内有害分子如病原体、毒素和抗原的渗透，同时可以适当吸收营养物质和水分[1]，肠上皮屏障功能障碍是肠道发病的主要原因[2]。紧密连接(Tight junction，TJ)在肠道上皮屏障中发挥着重要作用，其由跨膜蛋白Claudins、Occludin、Tricellulin和JAMs以及外周膜支架蛋白组成[2-3]。跨膜蛋白表达异常可导致屏障功能破坏和细胞旁通透性增加，引起肠腔内促炎分子的渗透，诱导黏膜免疫系统的激活，导致持续的炎症和肠道组织损伤。本文将阐述与肠道TJ相关的4种跨膜蛋白的基本概况及其在肠道疾病中的作用。

1 Claudins

1.1 Claudins的组成结构 Claudins是分子量为21～27 kDa的蛋白质家族，在人类和啮齿动物中至少有27个成员，是TJ的骨架，能够在没有任何其他跨膜蛋白的情况下形成TJ，是TJ蛋白中最为重要的一组蛋白，其对维持TJ的渗透性起着至关重要的作用[4]。Claudins含有4个跨膜结构域，2个高度保守的胞外环和1个胞内环。第1个胞外环平均含有大约53个氨基酸，是细胞旁路孔道形成的基础，对跨上皮电阻(Transepithelial electrical resistance，TEER)和细胞旁路的电荷选择均具有重要作用。第2个胞外环略小，含有大约24个氨基酸，主要起支持作用，有助于紧密连接束的形成，使细胞旁路的缝隙更加紧密[5]。Claudins还有2个N-末端和C-末端，位于细胞质内。N-末端通常很短，含4～10个氨基酸；C-末端长度不等，通常含21～63个氨基酸，存在特异性PDZ(PSD-95/DLG/Z01)结合区[6]，可与ZO蛋白的第1个PDZ结构域相互作用[7]。而ZO蛋白又与肌动蛋白丝连接，从而使TJ蛋白与细胞内骨架结构形成稳定的系统，参与细胞的信号传导[8]。另外，C-末端存在磷酸化位点(YV序列)，能在PKA、PKC等蛋白激酶的作用下发生磷酸化，磷酸化的Claudins蛋白可影响紧密连接的功能[8]。

1.2 Claudins的分类 按结构分类，Claudins可分为2种：一种是高度同源的，包括Claudin-1～10、14～15、17、19；另一种是非同源的，如Claudin-11～13、16、18、20～27[9]。按功能分类，Claudins可分为：①形成屏障，提供TJ细胞旁密封性的，如Claudin-1、3～5、8、11、14、19；②形成孔道，提供TJ细胞旁通透性的，如Claudin-2、10；③同时具有上述2种功能的，如Claudin-7、12、15～16[10]。按选择性分类，Claudin-2、10b、15是阳离子选择性的，Claudin-10a、17是阴离子选择性的，Claudin-2、8、9是水选择性的[11]。

1.3 Claudins蛋白在组织中的分布 同一种Claudin蛋白可能广泛表达于体内各种上皮组织；比如在肝脏、脑、肺、肠、脾、骨骼肌、肾脏、睾丸等器官组织均可鉴定出Claudin-1。而同一器官或组织中，也常存在多种Claudin蛋白的表达。例如肾脏中有Claudin-3～5、7、8、10、21、24～27[12]；肝脏中有Claudin-2～3；肺组织中有Claudin-2～5、7、8；脑组织中有Claudin-2～5。有些Claudin蛋白在特定的组织或器官中高表达，如Claudin-14高表达于耳蜗细胞；Claudin-15高表达于小肠黏膜细胞；Claudin-18高表达于破骨细胞[13]。有的Claudin蛋白的表达存在高度特异性，如Claudin-6仅在胚胎干细胞中表达。

即使在同一种组织，不同部位所表达的Claudins亦有差异，如在胃肠道的不同区段表达水平存在明显的差异：在人体，Claudin-2、15主要表达在胃肠道的近端[14]；Claudin-1主要在结肠表达[15]；Claudin-3、4、7、8主要在结肠、乙状结肠和直肠表达；Claudin-12在整个胃肠道均表达[16]。而在小鼠，Claudin-7在十二指肠、空肠、回肠、结肠中大量表达[17]；Claudin-8存在于回肠和结肠，在空肠和十二指肠中不存在；Claudin-12在回肠高表达，在空肠和结肠中表达，在十二指肠中几乎不表达；Claudin-13仅在结肠中表达，在其余的肠段中不表达；Claudin-15在十二指肠和空肠中高表达，从回肠到结肠的表达量逐渐减少[18]。胃肠道中Claudins家族成员的差异表达模式可能有助于TEER和细胞旁离子流的局部多样性。

1.4 Claudins蛋白功能及在肠道疾病中的作用

1.4.1 Claudins蛋白在肠道中的功能 Claudins蛋白能够维持上皮细胞的完整性，封闭细胞间的间隙，加强细胞间的紧密连接，调节细胞间各种离子和分子跨细胞旁路的被动转运。Claudins蛋白的结构异常、功能失调可导致细胞极性消失、细胞间紧密连接屏障破坏，进而导致内环境紊乱，是很多疾病的病理基础。

Claudins的含量及分子结构的变化通常可以对肠道产生3种典型的影响：①吸收通道减少；②小溶质和水分泌通道增加，导致腹泻；③大分子的吸收通过增加，可能诱发炎症反应。不同Claudins蛋白异常引起肠道疾病的病理生理机制不同，如Claudin-1、3、4、5、7、8减少溶质和水的细胞旁转运，即增强屏障作用；而Claudin-2、7、10、12、15增加溶质和水的细胞旁转运，即削弱屏障作用[11,19]。

1.4.2 Claudins蛋白与乳糜泻 乳糜泻是一种自身免疫性疾病，影响遗传易感个体的小肠。病理特征是绒毛萎缩，上皮内淋巴细胞计数增加(>30/100肠细胞)，固有层中的慢性炎症浸润和隐窝增生。在活动性乳糜泻中，细胞旁通透性增加，TJ形态发生显著改变。断裂电子显微镜显示，TJ网变薄且破损，深度减少，TJ链数减少，异常链和不连续链的数量增加，蛋白质进入黏膜层，诱导持续的免疫反应，肠道通透性增加。Schumann等[20]在患有活动性乳糜泻的患者的十二指肠活检中证实了通道形成蛋白Claudin-2、15的上调以及屏障形成蛋白Claudin-3、5、7的下调。

1.4.3 Claudins蛋白与炎症性肠病 溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn′s disease，CD)是慢性和复发性炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)，折磨了全世界数百万人，损害了他们的机体健康和生活质量。

UC是IBD的一种独特重要亚型，以慢性炎症和黏膜损伤为特征[21]，病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠，病理漫长，常反复发作。虽然发病机制尚未阐明，但越来越多的证据表明肠上皮屏障功能障碍在UC发展中至关重要。研究发现，在UC患者中Claudin-1、2、4、7的表达和再分布降低[22]，Claudin-2的表达增加[23]；活动性UC患者受损肠段中Claudin-1、3、4、5的表达均降低[24-25]。

CD患者整个肠道都可以被侵染，其病变肠段表现为上皮细胞TJ链减少，链断裂，TJ蛋白含量和组成改变，肠渗透性显著增加。在活动性CD患者的肠道中，冷冻断裂电子显微镜分析显示，起屏障作用的Claudin-4、5、8均明显下降并重新分布，而起通道作用的Claudin-2则明显上调，这构成了TJ变化的分子基础[26-27]。

1.4.4 Claudins蛋白与肠道易激综合征 肠道易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种慢性功能性疾病，所有患者的肠渗透性均增加。研究显示，IBS患者肠道的Claudin-4蛋白表达降低[28]，Claudin-1 mRNA和蛋白表达水平均降低[29]，Claudin-2、15的表达上调，肌球蛋白轻链磷酸化增加[30-32]。

2 Occludin

2.1 Occludin蛋白概述 Occludin是第1个鉴定的完整的膜TJ蛋白，没有发现同源物[33]，广泛存在于脑、肝、肺、肾等重要器官的上皮细胞和内皮细胞中。Occludin也是一种具有4个跨膜结构域的跨膜连接蛋白，相对分子量是65 kDa，由504个氨基酸构成。其除了有4个跨膜结构域，还有2个大的富含丝氨酸(Serine，Ser)、苏氨酸(Threomine，Thr)和酪氨酸(Tyrosine，Tyr)残基的细胞外环，1个由10个氨基酸残基构成的细胞内环，位于细胞质内的1个短的N-末端和1个长的C-末端[1]。Occludin的C末端尾部的Occludin-ELL结构域负责与ZO蛋白的GUK结构域相互作用[33]，促使细胞间连接更加稳定。Occludin一般通过形成同源二倍聚合体连接于两细胞间，其2个细胞外环介导同源相互作用和对大分子的渗透性。2个细胞外环的等电点都接近中性，第1个细胞外环含近61%的Tyr和甘氨酸(Glycine,Gly)残基，第2个细胞外环含有18%的Tyr残基。相邻细胞间的第1个外环相互交错形成封闭区域，而研究表明，缺少第2个细胞外环的Occludin蛋白在TJs中不存在，表明第2个细胞外环对Occludin蛋白稳定地组装进TJ是必不可少的[34]。研究表明，Occludin的敲低诱导了大分子细胞旁通透性的增加，表明Occludin在TJ的维持和组装中起作用[2]。

2.2 Occludin蛋白的磷酸化调节 Occludin蛋白存在磷酸化和去磷酸化2种形式，磷酸化是其活性形式。体外研究表明，Occludin的磷酸化可以调节Occludin的定位和TJ通透性，磷酸化增强屏障功能，而去磷酸化导致TJs组装延迟，屏障功能障碍[1,33]。Occludin的这种磷酸化受激酶和磷酸化酶位点之间平衡的调节。在完整的上皮细胞TJs处，Occludin在Ser和Thr残基上高度磷酸化[35]，而磷酸化残基较少的Occludin蛋白则多分布在细胞质的基底膜侧[34]。Ser或Thr磷酸化的作用是激活蛋白质的活性，调节细胞内的各种生命活动，其对Occludin的调节最为重要。在TJ拆卸过程中，Occludin在Ser和Thr残基上发生去磷酸化。有报道，蛋白质磷酸酶(PP)1和2A直接与Occludin相互作用，在Ser和Thr残基处使其去磷酸化。PP1优先在Ser残基上去磷酸化Occludin，而PP2A在Thr残基去磷酸化Occludin方面更具活性。PKC为蛋白激酶C，是C激酶通路的胞内效应酶，是一种脂质依赖性蛋白激酶，其作用包括调节代谢：使膜蛋白和多种酶蛋白Ser/Thr残基磷酸化。PKC g、PKC f与Occludin的磷酸化有关，其被激活后，作用于Occludin分子，使其磷酸化，从而调控细胞间的TJs，升高跨上皮电阻，增强细胞间连接的紧密性。PKC g、PKC f的减少或抑制可以诱导Occludin去磷酸化，导致TJ破坏。

其次，Tyr磷酸化也在Occludin的调节中发挥作用。Tyr磷酸化发生在Occludin的羧基端，磷酸化相比于非磷酸化的Tyr羧基端，结合的ZOs蛋白减少，从而使细胞间的极性和通透性增加，TJs功能减退，屏障功能下降。反之，Tyr去磷酸化则可增强细胞间阻力，降低细胞间通透性，TJ屏障功能上调。酪蛋白激酶Ⅰ和Ⅱ以及非受体酪氨酸激酶c-Src已被鉴定为与Occludin的磷酸化有关。完整上皮中Tyr磷酸化的Occludin水平非常低，过氧化氢、乙醇的生物代谢产物乙醛,都通过Occludin Tyr磷酸化依赖性方式破坏TJ[36-37]。

2.3 Occludin蛋白的功能及在肠道疾病中的作用 Occludin蛋白是TJs的重要组成部分，通过转染Occludin siRNA，可以减少细胞间紧密连接的形成。阻断Occludin的N-末端或C-末端的表达，能减少屏障的TEER，提示Occludin对TJ的结构及功能至关重要[2]。

Occludin在多种常见肠道疾病中都有明显的表达变化，如活动性CD患者肠道通透性显著增加，Occludin在TJ重新分布并明显下调[38]；UC患者Occludin蛋白表达降低和分布改变，用小檗碱(中药黄连最丰富和主要的活性异喹啉生物碱)治疗后Occludin表达显著上调，维持了肠黏膜屏障的完整性，减轻了肠道炎症[39]；活动性乳糜泻以及IBS患者的Occludin表达亦下调[20,33,40]。

3 JAM

3.1 JAM蛋白的概述 JAM属于免疫球蛋白超家族，其特征在于2个胞外Ig结构域，1个单跨膜结构域和1个短的胞内C端结构域，因此，在结构上与有4个跨膜结构域的TJ蛋白Occludin和Claudins明显不同[1]。JAM家族由3个经典成员(JAM-1、-2、-3)和4个相关分子(JAM-4、JAM-L、CAR、ESAM)组成，每个约40 kDa[41]，在上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞等细胞中表达。JAM家族成员的细胞外N-末端结构域通过同嗜性和嗜异性相互作用与各种配体结合，同嗜性相互作用在TJ和细胞-细胞边界的形成中起作用，而嗜异性相互作用在细胞-细胞黏附、白细胞和表皮/内皮细胞之间的结合、血小板活化和病毒识别中起作用。JAM蛋白的C-末端尾部还含有PDZ结合基序，其与ZO-1的第3个PDZ结构域相互作用[7]。

3.2 JAM的功能及在肠道疾病中的作用 作为TJ跨膜蛋白的成员之一，JAM蛋白能够调节细胞旁通透性，改善屏障功能，还能促进Occludin组装到TJ复合物。此外，体外化学趋化实验或体内炎症反应模型均证实，JAM能够限制白细胞通过TJ，表明JAM在白细胞从血管向炎症部位的迁移而响应炎症反应中也发挥重要作用[7,41]。JAM-1、JAM-4和CAR均在肠上皮细胞中表达，并参与TJ的调节和维持，影响肠道通透性和炎症反应[42]。在许多肠道疾病中，JAM均发生变化，如在CD和UC患者中，JAM-1的表达都减少，肠道通透性增加[1]。用单克隆JAM-1抗体治疗肠上皮细胞损伤，检测到跨上皮电阻(TEER)和屏障组装逐渐恢复正常[43]。最近的研究表明，JAM-1敲除小鼠的结肠与野生型小鼠相比，对葡聚糖和髓过氧化物酶有更高的渗透性；此外，在JAM-1基因敲除小鼠中，葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate，DSS)诱导的结肠损伤和炎症比野生型小鼠更严重[44]。以上的研究均证明，JAM对肠道屏障功能起着关键的作用。

4 Tricellulin

4.1 Tricellulin蛋白的概述 近年来，三细胞间的紧密连接越来越引起人们的重视，Tricellulin蛋白就是其中之一。其于2005年被发现[45]，称为MARVELD2，因为其与MARVELD1(Occludin)和MARVELD3 都是含有保守的4个跨膜结构域的MARVEL结构域蛋白，且存在于3个上皮细胞间，因此简称为Tric。人类Tric蛋白有4种亚型，即Tric-a、Tric-al、Tric-b、Tric-c，相对分子质量为63.5 kDa。Tric在各种上皮细胞中广泛表达，包括肠上皮细胞、肝细胞、鼻黏膜上皮细胞、耳蜗毛细胞和神经束膜细胞[46]。Tric主要分布于3个上皮细胞的交界处，有的也存在于稀疏的双细胞间[47]。有研究者将TJ 跨膜蛋白划分为3细胞间紧密连接tTJ (Tricellulin)和双细胞间紧密连接bTJ (Occludin、Claudins)[48]。tTJ在立体空间上构成了1个直径约10 nm的三细胞间“中央孔道”，与bTJ构成的两细胞间孔道相比，间隙更大，其作用可能与大分子或者细菌的细胞旁运输有关系[4]。而bTJ 构成的两细胞间隙则与离子和小分子物质的转运有关。结构上，Tric由2条长尾组成，N-末端和C-末端位于胞浆内，其中C-末端130 个(32%)氨基酸残基序列与Occludin一致，推测Tric也可受磷酸化的调节；其还含有Occludin-ELL结构域，可能与ZO蛋白的GUK结构域相互作用[49]。因此，Tric不仅是紧密连接的重要组成部分，在功能上与Occludin也能形成互补作用，在三细胞和双细胞TJ的组织和功能中都能起到关键作用[50]。

4.2 Tric蛋白的表达调控及其功能 Tric蛋白的表达受多种因素的影响，如①Occludin：敲除Occludin 的基因能引起Tric的定位异常[51]；②肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)：上调Tric的蛋白表达水平[52]；③c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)：JNK激动剂可以下调Tric的表达，而应用JNK抑制剂可逆转此变化[53]。

上皮细胞中过表达Tric能够有效阻止大分子的渗漏，低表达Tric则会降低TJ的形成及稳定性，影响屏障功能[49,54]。研究表明，将小鼠乳腺上皮Eph4细胞中的Tric敲除后，TJ结构遭到破坏，TEER下降，细胞旁通透性显著增加，而且bTJ的网状结构也受到了破坏[48]。在CaCo-2细胞内敲除Tric蛋白基因，也得到了上述结果[52]。在另一个敲除Occludin的MDCKlI细胞实验中，检测到Tric由tTJ向bTJ移位，这一过程可以被导入并表达Occludin蛋白基因逆转[55]，说明Tric对Occludin的缺失能起到部分代偿作用。

在肠道疾病中，Tric发挥着重要作用，如在UC中可以检测到Tric蛋白下调，并且其减少增加了大分子的通过。IL-13是UC的关键细胞因子，能够导致Tric的下调和Claudin-2的上调，造成屏障破坏，肠道渗透性增加。而靶向白细胞介素13受体α2 (Interleukin-13-receptor α2，IL13Rα2)会阻断UC导致的Tric减少，恢复屏障作用，阻止炎性大分子的渗入。因此，IL13Rα2通路可能在UC的治疗中有效，是治疗UC的新方法[54]。这些研究结果都提示，Tric在旁细胞途径的转运、维持TJ 网状结构及屏障功能以及肠道相关疾病的诊疗中发挥重要作用[50]。

5 总结与展望

肠上皮细胞间的TJ 是构成细胞旁物质转运途径的结构和功能基础。随着各种TJ跨膜蛋白陆续被发现并研究，TJ跨膜蛋白不仅是细胞旁的选择性屏障，很多TJ跨膜蛋白还参与调控细胞的生长、分化和信号转导等过程。在肠道，TJ跨膜蛋白种类繁多、结构复杂、功能不尽相同，其在肠道疾病的发生、发展和转归之间的复杂关系还需要更为细致的观察、分析和验证。随着肠道TJ跨膜蛋白研究的不断深入，其相关信号通路的激活因子及抑制因子的研究也越来越受到重视，这必将会为人们更好地了解肠道疾病并进行相应的靶向治疗提供更好的思路和依据。