非洲猪瘟病毒荧光PCR检测的污染控制

盛 敏

(河南省动物疫病预防控制中心,河南郑州 450000)

1 设施环境

当实验室只做荧光PCR方法时，应当设置以下区域：试剂准备室、核酸提取室、扩增分析室。试剂准备室用于贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应体系的配制，以及离心管、Tip头等消耗品的贮存和准备。核酸提取室用于样品处理、核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管。样品处理应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。扩增分析室用于DNA扩增及检测分析。这3个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，在使用中也始终处于完全的分隔状态，不能有空气直接相通。为防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域，造成污染，实验室的空气流向应按照试剂准备室→核酸提取室→扩增分析室进行。按照从试剂准备室→核酸提取室→扩增分析室方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装置或其他可行的方式实现。

2 样品

用于非洲猪瘟检测的样品是具有潜在传染危险性的材料，进行剪碎、研磨、离心及灭活处理时应在二级生物安全柜中进行，勿使液体溅到生物安全柜中，避免样品间交叉污染。装有样品的离心管一定要盖严，避免由于密封不严溢于容器外或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染。

3 仪器

在试验中用到的主要仪器有荧光PCR 仪、冷冻离心机、二生物安全柜、核酸提取仪、微量移液器等，要对这些仪器定期进行检定/校准或功能性检查，确保仪器处于正常工作状态。要保持荧光PCR 仪的清洁卫生，避免仪器内部被荧光物质污染。试剂准备室和核酸提取室都要有一套完整移液器（覆盖0.2～1000μl），互相不能调换使用。

4 试剂

使用市售商品化试剂盒的实验室，在收到试剂盒后应将盒内的阳性对照放置于核酸提取室，将荧光PCR预混液放置于试剂准备室。试剂盒中的阳性对照大多是重组质粒及高浓度阳性标本，在开盖吸取的时候一定要小心，一旦溅洒，污染样品的可能性很大。

5 人员

检测人员要具备良好的防污染意识和操作技能，到不同的区域时，要注意及时更换防护用品。在核酸提取室操作时，戴的一次性手套、口罩、帽子要勤换，避免污染。要带新的一次性PE手套对荧光 PCR管封盖，避免徒手或用过的手套接触荧光 PCR 管，检测过程中使用不带荧光物质的一次性手套。为避免污染，实验室在人员管理上要实行考核上岗和定期培训制度，检测人员要培训考核合格后才能上岗。

6 试验

6.1 基本原则

进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂准备室→核酸提取室→扩增分析室。各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。建议不同的工作区域使用不同的工作服（用颜色区分）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。实验室的清洁应当按试剂准备室→核酸提取室→扩增分析室的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

6.2 预混和分装试剂

扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。一般会将荧光PCR预混液小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。预混和分装试剂时只能用试剂准备室的移液器和 Tip头，禁止用其他区域的移液器和Tip头。

6.3 核酸提取加样

要认真按照试剂盒说明书或作业指导书步骤进行，防止试剂和样品受到气溶胶的污染。操作时要戴一次性手套，若不小心溅上反应液，应立即更换手套。开离心管时要用双手，动作要轻缓，防止液体溅出[1]。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面。用移液器吸取液体或加样时要十分小心，吸取要慢，吸取时尽量一次性完成，不要多次抽吸，如果有条件，可使用带滤芯的Tip头，以免交叉污染或产生气溶胶污染。加样时最后加阳性对照，减少阴性对照和样品被污染的概率。为避免样品间的交叉污染，加入待测核酸后，应立刻盖紧管盖。

6.4 扩增分析

在扩增分析室要尽量减少走动，以避免气溶胶所致的污染。因为荧光PCR扩增后不需要电泳，扩增后的反应管严禁打开，直接进行无害化处理。

6.5 清洁

试验结束后，必须立即对工作区进行清洁。通常采用次氯酸钠或紫外照射对工作区的实验台表面进行消毒清洁。次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用，从而使可能留在实验台面核酸被破坏掉。通常使用10%的次氯酸钠擦洗实验室，然后再用70%乙醇或清水洗去次氯酸钠。紫外照射非常方便有效，其去污效果取决于紫外照射的距离和能量。一般将可移动紫外灯（254nm波长）调至实验台上60～90cm内照射。由于荧光PCR扩增产物仅几百或几十碱基对，对紫外线损伤敏感度低，因此最好是照射过夜。