内质网应激在白癜风发病的研究进展

黄煜君，张峻岭，刘晓洁

白癜风是一种常见的色素脱失症，其特征在于表皮中的功能性黑素细胞和黑素的丧失，其中氧化应激产生的自身抗原和自身免疫性反应在白癜风的发病中起到重要的作用。各种因素引起白癜风黑素细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生过量以及ROS在黑素细胞中的积累，最终导致黑素细胞损伤和自身抗原的产生，其通过方式如下：①细胞凋亡；②由内质网应激诱导错误折叠的肽和细胞因子（如趋化因子）的积累及非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）；③由钙网蛋白触发吞噬细胞的“吃我”信号[1]。诱导型热休克蛋白70 的参与下，针对自身抗原的细胞免疫在黑素细胞破坏中占据重要位置，最终导致白癜风[2]，本文对内质网应激和趋化因子在白癜风发病机制中作用的研究进展进行综述。

1 内质网应激

1.1 内质网应激与白癜风

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞内的多层膜结构细胞器，在细胞所需的复合物分子的合成中起主要作用[3]，在完成基本生理功能的同时，ER 凭借其庞大的膜结构成为协调信号转导的枢纽平台。ER 为细胞内Ca2+的主要储存库[4]，由于其蛋白质折叠和转运功能，ER 存在大量Ca2+依赖分子伴侣，如钙网织蛋白等。ER 必须严格控制Ca2+水平，避免Ca2+失衡导致细胞死亡。遗传或环境损伤会引起细胞内缺氧、钙稳态失衡和分泌蛋白错误折叠或聚集，从而破环ER 功能，诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。ERS 时蛋白质不能正确折叠积聚在ER 腔内，细胞通过蛋白激酶R样内质网激酶-真核起始因子2α(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase-eukaryotic translationinitiation factor 2α，PERK-e IF2α）、肌醇需求酶1-X盒子结合蛋白（inositol-requiring enzyme 1a-X-boxbinding protein1，IRE1-XBP1）和转录激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6）一系列信号网络转导途径，提高蛋白质正确折叠能力、抑制蛋白质的产生和积聚、加速非功能性和隐含毒性蛋白降解，引发内ERS 相关基因的转录和加强ER 的自我修复能力，这些反应统称为UPR。ERS 过强或持续时间过久，UPR 不足以恢复ER 稳态，则最终引起细胞凋亡。ERS 的表现包括UPR、ER 相关性死亡和整合应激反应这3 个交互相联的动态过程[5]。综上所述，ERS 是ER 腔内错误折叠蛋白聚集形成的一种适应性反应，一方面UPR 被激活来抵御外界刺激所造成的有害影响，另一方面当 UPR 不足以重新构建ER稳态时，UPR 通路将诱导细胞凋亡信号而引起细胞凋亡。

相关研究表明，白癜风患者黑素细胞ER 有未折叠蛋白沉积，故推断ERS 为白癜风发病机制中的关键环节。2000 年，Le Poole 等[6]用逆转录病毒将人乳头瘤病毒（HPV）16 型的E6 和 E7 基因转染到白癜风患者黑素细胞系 Ma9308P4，组合成人永生白癜风黑素细胞系 PIG3V，并成功表达出酪氨酸酶，在PIG3V 细胞中发现了扩张的ER，并在ER 中发现蛋白质分子，初步证明ER 的扩张可能是蛋白质滞留引起。当ER 发生应激时，非折叠或错误折叠的多肽及没有组装好的蛋白将滞留在ER 腔，ERS 早期通过诱导UPR，使蛋白质的生物合成减少，降低ER 负担。随着 ERS 加剧，UPR 的激活被抑制，引起 ER摄取或释放 Ca2+障碍或蛋白质加工或运输障碍，细胞就会由生存向凋亡转换。此外，酪氨酸酶的转运障碍也可为ERS 参与白癜风发病的证据之一。Guan等[7]发现中国人群白癜风易感基因为VIT-1/FBXO11，沉默该基因可影响黑素细胞的超微结构。该研究表明InnVit基因被抑制后直接影响黑素细胞ER 的形态，酪氨酸酶表达量异常增加，并滞留于ER，提示酪氨酸酶非常态增多是蛋白酶体降解途径发生障碍导致的。

1.2 ERS的3种信号通路

真核细胞产生ERS 时，UPR 激活其典型3 种信号通路，这些信号通路根据其在ER 上发起效应器的不同分为蛋白激酶样内质网激酶（PKR like ER kinase，PERK）、1 型内质网转膜蛋白激酶（type-1ER transmembrane protein kinase，IRE1）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）3 类。在正常生理状态下，ER 腔区域的3 个跨膜受体蛋白PERK、IRE1 和ATF6 与GRP78/ Bi P 处于结合状态，形成稳定复合物，使它们处于未激活状态。当细胞ER 中蛋白质折叠紊乱，积累大量未折叠或错误折叠蛋白时，RP78/Bi P 作为ER 稳态感受器，与3 种UPR 效应器PERK、IRE1 和ATF6 解离，转而结合新生的未折叠蛋白，而被激活游离的3 种跨膜感受蛋白则激发UPR 信号级联反应[8,9]。

近期研究表明，UPR 信号通路参与了白癜风的发病机制。Spritz[10]发现编码XBP1 的基因可调节下游UPR 靶标的转录因子，与白癜风发病风险增加相关。Toosi 等[11]通过使用4-叔丁基苯酚和对苯二酚单苄基醚（已知的白癜风诱发剂）建立白癜风人体黑素细胞ERS 模型，结果显示黑素细胞暴露于这些化学物质可以激活UPR 并导致抗氧化反应的增强，并监测到PERK 及其下游靶标ATF4 的表达增加及EIF2α 磷酸化的增加。此外，在诱导剂给药后3 h 可检测到黑素细胞IRE1 的表达和磷酸化增加，并伴随XBP1 的剪接增加。

1.3 ERS相关蛋白

1.3.1 钙网织蛋白 钙网织蛋白（calreticulin，CRT），一种调节细胞内Ca2+的无处不在的ER 蛋白，定位于单核细胞、巨噬细胞等表面，介导抗原提呈，补体活化和凋亡细胞。对白癜风的研究发现，在氧化应激下，CRT 从ER 腔再分布到黑素细胞表面。然后表面CRT 可以指导ROS 应激黑素细胞接触树突状细胞（dendritic cells，DCs），然后激活下游免疫反应导致凋亡。CRT 的过表达增加黑素细胞对DC 诱导的免疫原性细胞凋亡的易感性[12]。此外，CRT 表达与白癜风持续时间和病变面积呈正相关[13]。CRT 介导的黑素细胞破坏可以诱导针对在氧化应激下的凋亡黑素细胞的免疫应答。

宋璞[14]研究发现，通过体外构建过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导的黑素细胞及角质形成细胞氧化应激模型，观察氧化应激状态下CRT、C1q 受体球状结构域（receptor for the C1q global domain，gC1qR）及CRT/gC1qR 复合体在黑素细胞及角质形成细胞应对氧化损伤的作用及分子机制，得出以下结论：①证实CRT 可增强黑素细胞免疫源性，通过DC 为主的抗原提成作用启动了CD8+T 淋巴细胞为主的特异性免疫反应。②持续的氧化应激诱导黑素细胞ER 及线粒体应激，CRT 膜外聚集，gC1qR进入细胞线粒体内蓄积，二者共同促进线粒体功能障碍，细胞凋亡；而在角质形成细胞中，gC1qR 与CRT 形成CRT/gC1qR 复合体则可阻止gC1qR 线粒体和核转位,促进细胞增殖或迁移。氧化应激可影响CRT、gC1qR 蛋白表达和亚细胞定位。

1.3.2 硫氧还蛋白结构域蛋白5 硫氧还原蛋白是一类在体内广泛表达的蛋白，可参与调控氧化还原反应。硫氧还原蛋白结构域5（thioredoxin domaincontaining protein 5，TXNDC5）属于其家族一员，在ER 中具有蛋白折叠和分子伴侣活性，其表达失调与氧化应激、细胞衰老以及关节炎、癌症、糖尿病、白癜风等的发病机制有关，这使得TXNDC5 成为易感生物标志物以及潜在的药理学靶点[15]。

7 个多态性已经与非节段性白癜风（nonsegmental vitiligo，NSV）相关联。单核苷酸多态性（seven single nucleotide polymorphisms，SNPs）代表人类基因组中最常见的遗传变异。多项研究表明TXNDC5基因中含有大量SNP。与病理有关的所有SNP 位于DNA 的非编码区（内含子，5'-UTR 和3'-UTR）。这些区域在TXNDC5的基因表达和调节起着关键作用。NSV 是一种被认为涉及TXNDC5 的多基因疾病[16]。ROS 可能是造成黑素细胞损伤的原因之一，也是蛋白质错误折叠的原因之一。根据这个假说，压力细胞不会死亡并且继续产生错误折叠的蛋白质，最终可能导致白癜风的发生[17]。

2 ERS与趋化因子

2.1 趋化因子与白癜风

趋化因子于1987 年首次被发现，是一类小分子蛋白家族，因具有趋化和激活白细胞的功能而被命名。人体内含有约50 种趋化因子，趋化因子通过激活细胞膜表面7 次跨膜的G 蛋白偶联受体发挥作用，这类受体称为趋化因子受体[18]。为初步探讨白癜风与趋化因子相关性，杨玲玲[19]采用Lummex 技术检测160 例白癜风患者和40 例健康对照组外周血血清中趋化因子含量，分析各种趋化因子与白癜风关系，结果显示，进展期患者血清C-X-C 型趋化因子7（C-X-C motifchemokines 7，CXCL7）、CXCL8、CXCL11、C-C 型趋化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、CCL4、CCL5、CCL22 水平较稳定期患者明显升高；寻常性白癜风患者血清CXCL8、CCL3水平较节段型显著升高，血清CCL3 水平与白斑总面积呈显著相关性；血清CXCL10 水平与年龄呈正相关。故趋化因子CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL10、CXCL11、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CCL22 在白癜风发生发展中起重要作用。

有研究发现病灶活动边界吸疱液中的CXCL9浓度是进展期白癜风的良好生物标志物，其敏感性为100%，特异性为93%。免疫组化研究也证实，CXCL9 在白癜风皮肤中的表达与疾病状态明显相关。同样，与稳定期的患者相比，进展期白癜风患者的皮损中CXCL10 mRNA 增加[20]。

相关研究提示，CXCL10 已成为白癜风的一种活性标志。CXCL10 是一种在干扰素（IFN）-γ 作用下产生的趋化因子，与其存在于诱导T 淋巴细胞归巢的淋巴细胞上的受体CXCR-3 结合，导致其吸引IFN-γ 产生病变和持续正循环。Abdallah 等[21]通过多中心临床实验，以免疫组化和血清学研究55 例NSV患者及对照组，结果与发现所有NSV 患者血清白细胞介素（IL）-6，CXCL-10 和IL-17 水平较对照组明显升高，且活动期和稳定期NSV 患者血清IFN-γ，IL-6，CXCL-10 和IL-17 水平显著升高。

CXCL16 在角质形成细胞中组成型表达，最近发现可介导人皮肤中CD8+T 淋巴细胞的归巢。Li 等[22]在暴露于H2O2的角质形成细胞中检测产生的趋化因子，并监测CXCL16-CXCR6 介导白癜风患者CD8+T 淋巴细胞的趋化性迁移。结果显示CXCL16 表达增加，与白癜风患者血清和病变氧化应激水平呈正相关。角质形成细胞内可观察诱导的CXCR6+CD8+T淋巴细胞的迁移。CXCR6+CD8+T 淋巴细胞浸润的白癜风患者皮损中黑素细胞明显减少。由此可以得出，CXCL16-CXCR6 在白癜风患者的氧化应激下介导CD8+T 淋巴细胞运输。

2.2 氧化应激与趋化因子

在白癜风患者的表皮中发现ROS 水平增加，ROS 可以导致抗氧化系统、黑素合成相关蛋白和黑素细胞膜脂质的各种改变，导致体内平衡紊乱和细胞生存障碍。此外，应激的黑素细胞发生凋亡，还可以分泌含有黑素细胞特异性抗原和免疫刺激信号的外来体，启动对黑素细胞的自身免疫反应，从而导致疾病进展。除黑素细胞外，角质形成细胞还可以被表皮中的氧化应激所击中。van den Boorn 等[23]通过建立皮肤外植体模型研究提示，白癜风患者CD8+T 淋巴细胞可浸润自体正常皮肤外植体并杀死黑素细胞，表明CD8+T 淋巴细胞参与疾病进展。然而，在ERS过程中，CD8+T 淋巴细胞是如何迁移到白癜风患者的病变中的还未完全清楚。

已经发现几种趋化因子是导致CD8+T 淋巴细胞皮损内转移的原因。转基因小鼠白癜风模型的研究表明，CD8+T 淋巴细胞在皮肤的积累主要取决于CXCR3，IFN-γ-CXCL10-CXCR3 轴对表皮色素脱失的进展和维持起着关键效应。最近，一个新的趋化因子对CXCL16-CXCR6 的相互作用已经被报道认为介导人皮肤中CD8+T 淋巴细胞的归巢。Li 等[22]为确定白癜风组织中趋化因子产生是否是由ERS 引起的，故平行检测了H2O2水平。结果发现，在所有分析的趋化因子中，CXCL16 和CXCL10 表达与H2O2的累积呈正相关。

2.3 信号通路PERK-eIF2α与趋化因子

为了深入了解PERK -eIF2α 途径介导的CXCL16表达的机制，研究者在JASPAR 数据库中筛选了候选转录因子，发现CXCL16 启动子的-2000 至+1 区域具有预测转录因子NF-κBp65（为一个转录因子蛋白家族的其中1 个亚单位）的结合位点。这是在ER 应激下由PERK介导的eIF2α磷酸化所激活的靶向因子。与此相同条件下，H2O2诱导的NF-κBp65 磷酸化可被HaCaT 细胞中的PERK 或eIF2α 的敲除所抑制。此外，敲除NF-κBp65 减弱了H2O2诱导的CXCL16蛋白表达。染色质免疫沉淀分析证实CXCL16 启动子的-149 至-388 片段是NF-κBp65 的结合位点。这些数据表明，UPR 的PERK-eIF2α 臂激活NF-κBp65参与人角质形成细胞中H2O2诱导的CXCL16 产生。

2.4 信号通路IRE1α-XBP1与趋化因子

除PERK 外，IRE1α-XBP1 是UPR 的另一个重要途径。UPR 的IRE1α-XBP1 分支的激活也在应激角质形成细胞中的CXCL16 表达中起重要作用。最新实验检测了IRE1α-XBP1 在人角质形成细胞中通过ROS 诱导CXCL16 的参与反应。在H2O2处理6 h 后IRE1α 的磷酸化显著增加，伴随着XBP1 剪接的增加。免疫荧光显示经H2O2处理的HaCaT 细胞中磷酸化的IRE1α的核分数和剪接的XBP1 增高，并且发现磷酸化的IRE1α 信号的比率（核/细胞质）增加，表明在白癜风患者中磷酸化的IRE1α 易出现位置更高的核易位。

3 结语

大量研究已经确定氧化应激是自身免疫启动的关键因素。白癜风是一种自身免疫性疾病，综上所述，ERS 及趋化因子在白癜风发病过程中发挥着重要的作用，越来越多的证据表明二者相互作用，协同形成相关作用信号，参与黑素细胞破坏。受损的角质形成细胞对氧化应激反应的CXCL16 表达增加在白癜风患者的CD8+T 淋巴细胞皮肤迁移中起关键作用。因此，针对UPR-CXCL16-CXCR6 轴可能为白癜风的治疗开辟新的方向。由ROS 诱导的角质形成细胞中的CXCL16表达至少部分通过2 种UPR 途径发生：PERK-eIF2α和IRE1α-XBP1。阻 断CXCL16-CXCR6 相互作用减轻CD8+T 淋巴细胞迁移，表明靶向ROS-CXCL16-CXCR6 轴可能是白癜风的有效治疗选择。