非编码RNA调节异常在肝细胞癌发生发展中的作用

刘树业

刘树业，天津市第三中心医院检验科 天津市 300170

核心提要：研究发现非编码RNA在肿瘤的发生发展与转移中作用重要，具较强诊断和治疗潜力，利于精准诊疗.但这些研究仍处于起步阶段，进一步研究肝脏ncRNAs与疾病进展的关系将是解决包括肝细胞癌在内的肝脏疾病的关键.

0 引言

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见恶性肿瘤之一，恶性程度极高，侵袭能力强，易转移，预后较差，严重危害人类健康.HCC是多种基因突变包括表观遗传改变、染色体易位、缺失和增加等都存在的复杂疾病，其产生的确切分子机制尚不完全清楚.HCC细胞极易侵袭门静脉系统形成癌栓，HCC门静脉癌栓的形成是影响HCC预后的重要因素.HCC起病隐匿，早期缺乏明显的临床症状，研究发现高效的HCC标志物有助于诊断HCC，提高疗效，改善预后.目前HCC的诊断主要依靠甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)和影像学技术.然而，AFP敏感性较低，诊断早期HCC的能力有限[1].近来有证据表明非编码RNA(Non-coding RNAs，ncRNAs)与HCC的发生、发展、诊断、治疗和预后等密切相关，可作为HCC早期诊断的新型分子标志物和新的有效治疗靶点.

HCC发生过程复杂.肝脏多次暴露于非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)、酗酒和病毒感染等容易引起纤维化和肝硬化的疾病后，经过一系列不良增生和发育变化，最终发展成HCC.从微观角度看，HCC则是癌基因和抑癌基因在细胞增殖、血管生成、凋亡、细胞迁移和转移等过程中的调控紊乱所致.其中，c-MET信号通路[2]、磷脂酰肌3-激酶(PI3 K/Akt/mTOR通路)[3]、Wnt/β-catenin通路[4]、TGF-β信号路径[5]等是影响细胞增殖、侵袭和转移的关键分子通路.

ncRNAs是由DNA转录但不翻译成蛋白质的功能性RNA.ncRNAs通过与DNA或RNA结合调节基因表达，导致其基因转录和翻译过程中降解或改变[5].ncRNAs作为一类特殊的RNA分子，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和环状RNA(circle RNA，circRNA)，具有调控基因表达、参与表观遗传修饰、细胞增殖及细胞凋亡等多种生命活动的功能，参与生长、分化、发育、免疫，甚至在肿瘤的形成等多种生物学进程.

ncRNAs在HCC中的研究是目前比较前沿的研究领域，现就ncRNAs(主要包括miRNA、lncRNA和circRNA)在HCC中的研究进展进行述评.

1 miRNA与HCC

ncRNAs中研究最多的是miRNA，miRNA是一种内源性小ncRNAs分子，大约由21-25个核苷酸组成，主要促进靶基因的转录后调控.原代miRNA通过RNA聚合酶Ⅱ从miRNA基因转录而来[6].大于60%的蛋白编码基因的翻译由miRNA调控[7].miRNA调节细胞增殖、凋亡、分化和发育.一个miRNA能够抑制多个基因的表达，多个miRNA也能共同作用一个靶点.

miRNA在肝脏中扮演着维持肝脏稳态的关键角色.miRNA失调与肝脏疾病(如病毒感染、炎症、脂糖代谢等)相关，并促进HCC进展.miR-122，miR-192，miR-21，miR-223，miR-26a，miR-27a and miR-801等7个miRNA联合诊断早期HCC，对小于2 cm的HCC诊断准确率接近90%，效果优于传统检测方法[8].

1.1 miRNA促进HCC发生和进展 在HCC中，miRNA失调导致靶基因异常表达，促进异常细胞生长、分化、血管生成导致HCC的发生、进展、侵袭和转移.肝细胞特异性Dicer-1 KO小鼠自发形成HCC意味着肝脏miRNA在HCC中发挥重要生物学作用[9].此外，Dicer-1 KO小鼠肝脏中4种肝脏特异性miRNA(miR-122、-148a、-192和-194)明显下调.

在肝细胞中，miR-122对维持肝细胞分化和脂质代谢调节等生理功能至关重要[10].miR-122 KO小鼠在经历肝炎、脂肪肝、纤维化后，发展为自发性HCC[11].在NASH啮鼠模型中，miR-122水平在HCC发生和进展过程中降低[12]，其靶基因，包括ADAM10、血清应答因子、胰岛素类生长因子1受体[13]和Wnt1[14]，参与HCC进展.在HCC患者中，miR-122低表达与不良预后和转移相关[15]，其缺失促进细胞迁移和侵袭等运动特性.此外，miR-122和c-Myc之间的负反馈循环促进HCC进展.miR-122通过靶向调节Tfdp2和E2f1来抑制c-Myc的表达，而c-Myc则通过转录抑制miR-122表达[16].miR-122还通过靶向调控Snail1和Snail2以及抑制Wnt/b-catenin通路，抑制HCC中的EMT[17]，过表达miR-122可减弱EMT启动子基因Ga12对c-Met、ERK、STAT3、Akt/mTOR通路的影响，抑制HCC的增殖和凋亡[18].

miR-148a抑制与HCC中a-胎蛋白水平高、TNM分期差、无复发生存率低有关.门静脉肿瘤血栓患者中miR-148a水平下降[19].研究发现miR-148a在HCC微血管浸润患者中水平也比较低.小鼠miR-148a缺失促进二乙基亚硝胺诱导HCC形成[20].同样，肝脏PTEN缺失的小鼠miR-148a过表达抑制肿瘤生长[21].此外，miR-148a失调与HCC预后不良有关.在原位肝移植模型中，miR-148a上调通过直接抑制c-Met进而抑制EMT和细胞侵袭，减少锌指转录因子Snail的核积聚[15]，抑制细胞向肺部迁移；其降低导致HPIP/AKT/ERK/FOXO4/ATF5/mTOR通路激活，促进EMT、侵袭和转移[14].而miR-148a靶点之一的USP4过表达通过激活TGF-b通路促进HCC进展[22].

miR-192失调与HCC预后不良相关[23].HCC患者miR-192水平降低，在微血管浸润或肿瘤体积较大的标本中miR-192水平更低[18].miR-192通过靶向溶质载体家族39成员6(SLC39A6)抑制HCC细胞转移，进而上调E-cadherin，下调锌指转录因子Snail表达；以转录后方式抑制lncRNA HOTTIP表达，降低HCC细胞生存能力[24]；抑制p53介导的ZEB2，抑制HCC细胞中EMT[25].Mir-194监管肝脏Wnt配体的膜受体信号Fzd6.体外实验显示miR-194在肝上皮细胞中高度表达，在二乙基亚硝胺诱导的FXR-/-HCC模型中表达水平降低[26].研究发现miR-194抑制多个与EMT和转移相关的基因(如CDH2和RAC1).另外，HNF1a是肝细胞功能的重要调控因子，其过表达可重建miR-192、194等肝脏特异性基因的表达，抑制细胞增殖[27].

1.2 miRNA在HCC临床应用中的意义 miRNA可作为HCC的重要预后标志物.比如miR-122水平与HCC的肿瘤大小和转移负相关[28]，miR-148a失调与HCC患者生存率降低有关[29].miR-192也是HCC患者预后的独立预测因子[23].miR-194的降低与HCC患者肿瘤大小、组织学分级、肝内转移等临床病理参数存在显著相关性[29].此外，miR-199a可作为HCC患者无瘤生存降低的独立预测因子.miR-135a上调在HCC门静脉肿瘤血栓中得到证实[30].

血清miR-221水平升高与HCC患者肿瘤大小、TNM分期和总生存率相关.此外，循环miR-221水平与晚期HCC患者索拉非尼治疗反应相关，可用于预测治疗反应率[31].在血液标本中，miR-21、miR-148a、miR-192和miR-224对HCC具有显著的预测价值[32].HCC患者血清中miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p和miR-375水平升高，可诊断早期HCC[33].miR-15b和miR-130b水平也升高[31]，与HCC传统血清标志物相比，血清miR-16敏感性更高[34].

随研究进展，专注于调控miRNA的策略将是治疗HCC的一种新方法.多种miRNA在不同肝脏疾病中的调控已显示出其在治疗HCC中的潜在有效性.miR-122是一种肝特异性肿瘤抑制因子，向miR-122 KO小鼠中注射miR-122a表现为HCC癌变和进展受损，上调miR-122可能是一种成功治疗HCC的策略[35].另一项研究证实，瘤内注射miR-122能增强异种移植模型中索拉非尼对HCC的抗肿瘤作用[36].此外，miR-26a在HCC小鼠模型中通过诱导肿瘤特异性细胞周期阻滞和凋亡抑制肿瘤发生.相反，通过释放anti-miR-221寡核苷酸抑制致癌基因miR-221可使肿瘤生长显著下降[37].

2 lncRNA与HCC

LncRNA长度超过200nt，转录和处理与蛋白编码基因相同，是哺乳动物非编码转录组的主要组成部分.其保守性差，基因表达调控机制尚不完全清楚[38].近年来大量研究表明lncRNA通过在转录、转录后以及表观遗传水平参与基因的表达调控，并以此影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等过程，与HCC发生、发展的病理生理机制及患者预后密切相关.因此lncRNA有潜力作为疾病诊断的标志物和潜在的药物靶点，研究成果将有助于开发新型靶向治疗方案，意义重大.

2.1 lncRNA与HCC发生发展的关系 HULC是高度保守的lncRNA，也是HCC中上调最多的基因.HULC与HCC患者的PTEN、miR-15a表达负相关，促进恶性进展[39].HULC作为miR-9、miR-107和miR-372等miRNA海绵，分别诱导PPARA、E2F1和CREB，从而促进HCC发展[40].lncRNA MALAT1在HCC中上调，通过上调SRSF1和激活mTOR通路发挥致癌基因的作用[41].

相比之下，人类母系表达基因3(MEG3)、AOC4P和DREHL ncRNA具有肿瘤抑制作用.MEG3被认为是HCC的独立预后因素，因为与HCC患者中MEG3的高表达相比，MEG3的低表达与较差的总生存率和无复发生存率相关[42].MEG3过表达明显抑制细胞生长，激活细胞凋亡[43].同样，在HCC患者中AOC4P表达显著抑制，与TNM分期、包膜浸润、血管浸润呈负相关[44].

LncRNA在EMT和转移中也发挥着关键作用.LncRNA-NEF被EMT抑制因子FOXA2转录激活，显著抑制EMT和细胞迁移[45].LncRNA CPS1-IT1通过抑制HIF-1a和抑制EMT发挥抑癌作用[46].ZEB1-as1通过上调ZEB1促进EMT和转移[47]，在HCC样本尤其是转移瘤组织中升高.

HULC还通过与miR-200a竞争，诱导EMT，促进肿瘤进展和转移[48].Jang等[48]发现HULC的表达与TNM分期、肝内转移、HCC复发和术后生存相关.LncRNAATB在HCC组织中也显著升高，且与肝内或肝外转移呈正相关.Li等[49]研究发现，LINC01138高表达的HCC患者肿瘤体积较大，且高表达与HCC患者的AFP含量以及乙肝表面抗原阳性呈正相关，而且高表达HCC患者预后较差.体外与体内功能实验揭示LINC01138可以显着促进HCC细胞的增殖、侵袭与转移能力.Zhang等[50]在HCC中通过RNA-Seq的方法鉴定到了一种肿瘤特异性的LIN28B转录本变异体LIN28B-TST，并且发现该转录本的表达受DNA甲基化的调控，该转录本编码一种具有外加N端氨基酸序列的蛋白异构体，对于促进肿瘤的增殖生长具有重要作用.

2.2 lncRNA与HCC临床诊治中的潜在应用价值 lncRNA在肝组织中特异性表达.通过meta分析发现AFAPAS1、HOTTIP、ZEB-1-AS1等27种LncRNA高表达与预后不良密切相关，GAS5、MEG3、XIST等18种LncRNA低表达会加剧恶化[51].

HCC患者HULC水平升高，且与Edmondson组织学分级呈正相关[52].UCA1和WRAP53的表达增加也与肿瘤恶性程度相关.此外，结合LncRNA和血清AFP联合检测可提高HCC诊断的敏感性[53].分析血清中uc001ncr和AX800134表达情况发现LncRNA有可能成为诊断HCC的新型标志物，尤其当早期HCCAFP小于等于400 ng/mL时[44].

除此之外，RP11-160H22.5、XLOC_014172和LOC149086等3种潜在的诊断lncRNA也被提出，其中XLOC_014172和LOC149086在转移性HCC患者中均显著升高[54].总结出HCC相关ncRNA，如HULC，Linc00152，HEIH，HOTTIP，HOTAIR，MALAT1，DILC，ZFAS1，MEG3，PRAL，LALR1，LET，MVIH，PCNA-AS，TUC338，UC001NCR.

MRX34是包裹在脂质体纳米颗粒中的miR-34a合成版本，在一期临床试验中显示出HCC抗肿瘤活性[55].第一种miRNA靶向药物米雷韦森(miravirsen)，一种lna修饰的anti-miR-122 DNA-RNA杂化寡核苷酸，正在进行慢性丙肝治疗的II期临床试验[56].

3 环状RNA与HCC

circRNA是封闭的环状分子，作为ncRNA家族的一部分，circRNA通常以组织和发育阶段特异性方式表达，而且表达丰度高.它在疾病的变化发展中先于蛋白类标志物，在血清中表达很稳定，因此它作为HCC早期诊断及预后的标志物具有很好的临床应用前景.

3.1 环状RNA在HCC发生、进展中的作用 环状RNA在HCC的发生发展发挥着重要作用.CDRIas(Hsa_circ_0001946)通过靶向抑制miR-7功能提高HCC细胞的增殖能力[57]；circMT01(Hsa_circ_0007874)通过充当miR-9的分子海绵进而提高P21表达实现抑癌作用[58]；circRNA_000839(Hsa circ_0000497)可能通过与miR-200b和RhoA的相互作用影响HCC发生和发展[59]；circITC H通过抑制Wnt/p -Catenin pathway信号通路抑制HCC[60].Hsa circ_0001649可通过靶向SHPRH基因来发挥其抑制HCC的作用[61]CircHIPK3(Hsa_circ_0000284)可以作为miR-124的分子海绵促进HCC细胞生长[62]；与HCC的发生密切相关的circFUT8(Hsa_circ_0003028)，circZFR(Hsa circ_103809)以及circIP011(Hsa circ_0007915)可靶向多个miRNA发挥作用[63]；cSMARCAS(Hsa_circ_0001445)通过充当miR-17-3p和miR-181b-5p的分子海绵促进抑癌基因TIMP3的表达，从而抑制HCC细胞的增殖和转移；CircC3P1通过对miR-4641的海绵作用促进PCK1的表达，从而发挥其抑制HCC生长及转移的作用[64].

3.2 环状RNA在HCC诊断与治疗中的应用 circRNA有望成为理想的HCC分子标志物.Yao等[65]通过建立受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)评估circZKSCANI(Hsa_circ_0001727)在鉴别HCC组织及邻近正常组织时的价值，发现其受试者工作特征曲线下面积((area under curve，AUC)为0.834，灵敏度为82.2%，特异度为72.4%；Qin等[66]通过ROC曲线评估Hsa_circ_0001649在鉴别HCC组织及邻近正常组织的AUC为0.63，灵敏度为0.81，特异度为0.69.Shang等[67]发现Hsa circ_0005075鉴别HCC组织和癌旁正常组织时AUC为0.94，灵敏度为83.3%，特异度为90.0%；ROC曲线评估血浆Hsa circ_0001445诊断HCC患者较AFP具有更高的灵敏度，在鉴别HCC患者和正常人时其AUC为0.862，灵敏度为71.2%，特异度为94.2%.

另外，Hsa_circ_0016788可以通过miR-486/CDK4信号通路促进HCC细胞生长，表明Hsa_circ_0016788在HCC治疗中具有很大的研究价值[68].Hsa circ_0067934可以通过抑制miR-1324的功能以及激活FZD5/β-catenin信号通路提高HCC细胞增殖、转移、侵袭的能力，提示Hsa_circ_0067934/miR-1324/FZD5/β-catenin信号轴有望成为HCC治疗的新靶标[69].

4 结论

ncRNAs的异常表达与人类各种疾病尤其与恶性肿瘤的发生发展密切相关，相关研究已成为当今HCC研究领域的热点和重要科学问题.近年研究对ncRNAs在人类恶性肿瘤特别是HCC中的作用、分子机制及临床意义进行了深入系统的探索，取得系列创新性研究成果，充分揭示ncRNAs不仅在肿瘤的发生发展与转移中发挥重要作用，而且可作为癌症诊断与分型、转移复发与预后预测分子标志物；另外，ncRNAs还可以作为癌症治疗靶标及新的治疗手段，为肿瘤精准诊断与精准治疗带来新的机遇.

然而，ncRNAs数量繁多，大部分ncRNAs功能及调控机制有待进一步明确.虽然已经发现多种与HCC发生发展及转移密切相关的ncRNAs.而且，几种基于ncRNAs的癌症治疗方法已在临床试验中得到检验，但这些研究仍处于起步阶段.因此，进一步研究肝脏ncRNA与疾病进展的关系将是解决包括HCC在内的肝脏疾病的关键.