我国蔗区甘蔗宿根矮化病发生情况的分子检测

沈林波，吴楠楠,2，冯小艳，王文治，熊国如，赵婷婷，张树珍

(1.中国热带农业科学院 甘蔗研究中心/热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口, 571101；2.南京农业大学 生命科学学院，南京，210095)

甘蔗宿根矮化病(Sugarcane Ratoon Stunting Disease ,RSD)是影响甘蔗产量和品质的一种细菌性病害，1944年，在澳大利亚蔗区的甘蔗品种Q28上首次发现该病害[1]，目前，该病害在全球各个蔗区均广泛分布[2-4]。甘蔗宿根矮化病在发病初期没有典型的外部症状，在发病严重时才表现出明显症状，表现为蔗株矮化、分蘖减少、蔗茎变细、节间缩短、生长不良、田间植株高矮不齐等[5]，这些症状与甘蔗在干旱、养分不足时的表现相似，因此，从外观上很难判断蔗株是否发病。甘蔗宿根矮化病有时会表现出内部症状，感病的幼嫩蔗株的生长点变成淡粉色，成熟蔗株近基部节部维管束变色，出现橘红色或红褐色的小圆点、逗点、短线状病变，但是这些症状有时不会表现出来[6]。甘蔗宿根矮化病的病原菌是木质部赖氏菌木质部亚种(Leifsoniaxylisubsp.xyli, Lxx)[7]，一种专性寄生于木质部维管束中的革兰氏阳性菌，菌体呈直或微弯的细长棒状，有的中部或一端膨大，内有间体，菌体大小为0.25～0.5μm×1.0～4.0μm。Lxx主要通过带菌蔗种、收获机具和砍种刀具等媒介进行传播[8-9]。甘蔗在宿根时，随着宿根年数的增长，宿根矮化病所造成的病蔗的蔗汁稀释至10 000 倍仍具有传染力，传染性极强[10]。此外，动物在咀嚼带病甘蔗后咬食健康的甘蔗也会传播该病菌[11]。甘蔗宿根矮化病会造成有效茎数、单茎重、蔗糖分量的减少，从而影响甘蔗的产量和品质[12-13]，可使甘蔗产量减产10%～30%[13-16]。在干旱缺水的条件下，宿根矮化病发病严重时，甘蔗产量减产可高达60%[7]，蔗糖分降低0.5%，经济损失巨大。目前，种植甘蔗脱毒种苗是预防甘蔗宿根矮化病的最有效措施，巴西、印度、古巴等甘蔗生产大国均采用种植甘蔗脱毒种苗的途径来防治甘蔗宿根矮化病[4]。甘蔗宿根矮化病在发病不严重时没有明显的外部症状，难以从外观上进行诊断，同时病原菌Lxx的分离培养较困难，因此聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测法是目前检测 RSD使用最广泛和准确的方法[17-18]。笔者从我国甘蔗主产区的12个甘蔗产区(简称蔗区)收集甘蔗样品598份，利用PCR方法对RSD的病原菌Lxx进行分子检测，旨在明确我国蔗区甘蔗宿根矮化病的发生情况，为甘蔗脱毒健康种苗的推广应用及有效防控甘蔗宿根矮化病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料2017年从广西、云南、广东和海南等省份12个代表性蔗区采集显症或不显症的甘蔗叶片样品598份。以本实验室保存的经过鉴定感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗叶片为阳性对照，灭菌双蒸水为空白对照。

1.2 试剂甘蔗DNA提取相关试剂(Sigma)，PCR相关试剂(TaKaRa)，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit(Axygen)，琼脂糖(Sigma)，引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，其他常用的化学试剂均为国产分析纯。

1.3 甘蔗叶片总DNA的提取甘蔗叶片总DNA的提取采用CTAB法[19]，取200 mg甘蔗叶片，剪碎后用液氮研磨成粉末，装入2.0 mL的离心管中，加入1 mL 65 ℃预热的CTAB裂解缓冲液(0.1 mol·L-1Tris-Cl pH8.0, 1.4 mol·L-1NaCl, 0.02 mol·L-1EDTA pH8.0, 2% CTAB, 2%PVP, 3%β-巯基乙醇)，混匀后于65 ℃温浴1 h。加入1mL的V氯仿∶V异戊醇=24∶1，颠倒混匀，常温10 000 r·min-1离心10 min。转移上清液至新的离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，于-20 ℃放置10 min，常温10 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，用75%的乙醇洗涤沉淀2次，常温10 000 r·min-1离心2 min；弃上清，用80 μL ddH2O溶解沉淀,于-20 ℃保存备用。取1μL DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.4 PCR检测引物采用Lxx的16S～23S rDNA基因间隔区特异引物Lxx1: 5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx2：5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′，目的片段大小为438 bp，PCR反应体系为：10×buffer 2.0 μL，dNTP 1.6 μL，Lxx1和Lxx2(10 μmol·L-1)各1μL，DNA模板1μL，rTaq酶0.14 μL，加 ddH2O补足 20 μL 。扩增程序为：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环， 72 ℃ 10 min[20-21]。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.5 PCR产物序列分析对部分PCR阳性扩增产物用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit (Axygen)试剂盒进行凝胶回收，回收产物连接19T载体上，转化到大肠杆菌 DH5α感受态细胞中，挑取单克隆，将菌液检测结果呈阳性的样品送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果在NCBI数据库中进行Blast同源性分析。

1.6 分析12个蔗区甘蔗宿根矮化病的发病情况统计分析12个蔗区收集的甘蔗样品中RSD检测呈阳性的样品数，并计算12个蔗区甘蔗宿根矮化病的发病率。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果用Lxx的特异性引物对Lxx1和Lxx2进行RT-PCR检测，结果显示：阳性对照及部分样品(图1)可以扩增得到大小约为438 bp目的条带，空白对照无目的条带。随机挑选部分阳性样品PCR的产物进行测序，测序结果经Blast同源性分析显示，与已报道的Lxx的16S～23S rDNA核酸序列(EU723209.1，AF034641.1)有高达99%的同源性，表明它们是Lxx基因组的部分序列，这些样品中存在Lxx细菌，说明样品已感染了宿根矮化病。

图1 部分样品RSD的PCR检测M：MarkerDL2000；1：阳性对照， 2：无菌双蒸水；3～24：甘蔗样品Fig.1 PCR detection of RSD in partial samples M: MarkerDL2000; 1: Positive control; 2: Sterile double distilled water; 3-24: Sugarcane samples

2.2 我国12个蔗区甘蔗宿根矮化病的发病情况对我国12个蔗区的RSD检测结果进行统计分析，结果(表1)显示，来源于12个蔗区的598个样品中有99个样品的检测结果为阳性，平均检出率为16.56%。12个蔗区的RSD检出率各不相同，其中RSD在临沧蔗区的检出率最高，为27.78%，其次是德宏蔗区，检出率为25.00%，南宁蔗区的检出率最低，4.88%，百色、柳城、崇左、保山、湛江和临高等蔗区的RSD检出率均较低，在5.45%～9.76%之间。

表1 我国12个蔗区甘蔗宿根矮化病的发生情况

2.3 不同甘蔗栽培品种RSD发生情况对15个甘蔗栽培品种RSD的检测结果进行统计(表2)，结果显示，15个甘蔗栽培品种均能检测到RSD，阳性检出率为15.38%～44.44%，其中新台糖22号RSD发病最严重，阳性检出率为44.44%，新台糖16号和粤糖93-159 RSD发病较严重，分别为42.86%和40.00%，海蔗22号RSD发病最轻，阳性检出率为15.38%，其余11个甘蔗品种的RSD阳性检出率为16.67%～37.75%。

表2 不同甘蔗栽培品种RSD发生情况

3 讨 论

通常PCR检测RSD使用的材料多为甘蔗汁，但是由于甘蔗汁取样过程繁琐、易污染，且组培苗和处于苗期的甘蔗无法取汁，因此，使用甘蔗汁作为检测材料具有局限性，而使用甘蔗叶片作为检测材料可避免上述情况[22]。赵婷婷等[20, 23]使用甘蔗植株不同位置的叶片及叶片的不同部位作为材料来检测RSD，发现PCR检测效率差异不明显。因此，本研究采用甘蔗叶片作为材料，通过PCR法进行RSD的检测。

王晓燕等[13]在2012—2014年，对云南省18个蔗区宿根矮化病的发生情况进行了检测，发现18个蔗区都检测到RSD，检出率为75.62%，28个主栽品种均感染RSD，检出率51.2%～100%，粤糖93-159、粤糖00-236等10个甘蔗品种感病严重，RSD在云南省各蔗区普遍发生且危害严重。韦金菊等[12]在2013—2014年，对广西蔗区9个主产区的宿根矮化病的发生情况进行检测，发现9个主产区均检测出RSD，阳性检出率为71.22%；27个甘蔗品种均能检测到RSD，其中主栽品种新台糖22号发病严重，检出率达80.8%；新植蔗的RSD检出率为36.0%，宿根蔗的RSD检出率为75.7%，宿根时间越长，RSD检出率越高，宿根矮化病在广西蔗区发生严重。本研究共收集了598份甘蔗样品，其中99份能检测到宿根矮化病，全国蔗区平均检出率为16.56%，全国12个蔗区均能检测到RSD，云南蔗区的RSD检出率为21.28%，广西蔗区的RSD检出率为17.42%。收集到的15个主要甘蔗栽培品种均能检测到RSD，阳性检出率为15.38%～44.44%，其中新台糖22号RSD发病最严重，阳性检出率为44.44%，海蔗22号RSD发病最轻，阳性检出率为15.38%。对比前人的报道，发现云南蔗区和广西蔗区甘蔗宿根矮化病的检出率均大幅度下降，云南蔗区的RSD检出率降低了54.34%，广西蔗区的RSD检出率降低了53.80%。结果表明，虽然宿根矮化病在我国蔗区仍然普遍存在，但是由于我国近年采取推广种植甘蔗脱毒健康种苗等防治措施，宿根矮化病的发生已得到了很大程度的控制。目前，预防宿根矮化病发生的最有效措施就是种植甘蔗脱毒健康种苗。虽然我国蔗区现在宿根矮化病的发生比2012—2014年有所降低，但是其在我国蔗区仍然普遍存在，而且在15个甘蔗主要栽培品种上均有检测到了RSD，说明目前对宿根矮化病的预防还需重视，在今后的甘蔗生产中应加大力度推广种植甘蔗脱毒健康种苗。