氚水诱发染色体畸变的研究进展

王春燕(中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，北京，100088)

刘玉龙 (苏州大学第二附属医院，江苏 苏州，215004)

氚是产生轻核聚变反应的重要核素之一，也是造成放射性工作人员内污染的主要核素之一[1]。氚和其它主要放射性核素相比，虽然毒性较低，国际放射防护委员会(ICRP) 把它定为低毒类放射性核素[2]，但是，氚与氢的化学性质相似，可以通过同位素交换反应而进入相应的物质分子当中[3]。在地球上的各种生物圈之中，氚无处不在。核爆炸和核反应堆运行也会释放大量的氚到环境中，远大于天然氚，并在自然界生态链中转移[4-6]。所以，氚对人类健康的影响应持续关注。

本文介绍了氚的毒理学特性，以及氚水对哺乳动物、细胞系及人离体细胞的辐射损伤导致的微核和染色体畸变的研究进展。

1 氚的毒理学特性

氚是氢的放射性同位素，氚通过β粒子衰变转变为稳定的氦同位素，发射平均能量为5.7 keV的低能电子以及反中微子粒子。最大能量18.6 keV，半衰期为12.3 a。氚发射的β粒子的路径长度仅为0.6 μm，小于细胞核直径[7]。由于射程短，氚不易对人体产生外照射危害，但由于较长的半衰期及较高的同位素交换率和氧化率，进入机体后会对人体组织和器官造成内照射危害。因此，如果氚通过饮用水或食物摄入，或通过皮肤吸入或吸收进入人体，就会对机体健康产生危害，氚在细胞内产生电离，引起细胞单链断裂，导致基因突变[8]。作为氢的同位素，氚容易形成水分子，因此在环境中非常易于移动，并且结合到有机分子中以形成有机结合的氚(OBT)[9]。理论和实验研究表明，氚β粒子在DNA中产生双链断裂(DSBs)特别有效，包括复杂的DSB[10-13]被认为是最有害的DNA损伤类型，如果留下未修复或不正确修复，可能导致染色体损伤，基因组不稳定和癌症[14-16]。

环境中的氚主要来自于天然氚和人工氚，并以氚气(HT)、氚水(HTO)和有机结合氚(OBT)化学态存在。另外，核电站、核爆炸和核反应堆运行也会释放大量的氚到环境中，且远大于天然氚，排放到环境中的氚可与氢交换，随氢的循环在不同环境介质和生物体内迁移转化[17-20]。

2 氚诱发体内细胞染色体畸变的研究

2.1 氚诱发小鼠染色体畸变研究

辐射诱发的哺乳类生殖细胞遗传损伤中，染色体畸变是最主要的指标之一，在各类畸变中,相互易位型畸变更具危险性。它们能传递到子代，进而导致后代的许多严重遗传疾患。

姜涛等[21]通过观察初级精母细胞D-MI中的多价体探讨氚水诱发精原细胞染色体易位的剂量-效应关系。采用小鼠一次腹腔注射法，氚水注入量分别为3.22×102、6.44×102、11.06×102、21.76×102和31.23×102kBq/g, 小鼠睾丸组织65天累积吸收剂量分别为 0.070、0.140、0.242、0.476和0.684 Gy。中毒后65天处死小鼠。结果发现，易位率随氚水剂量的增加而升高, 剂量-效应关系可拟合为直线方程Y=0.581+0.0366X。 精原细胞易位产物主要为D-MI中的链状四价体,占总畸变的77.8%；其次为链状六价体、链状三价体加单价体,分别占总畸变的11.1%和9.7%；环状四价体最少,仅占1.4%。在啮齿类动物中,由于生殖细胞在进行减数分裂时染色体在一条或多条臂间发生交叉的频率比较低,所以易位染色体形成环状多价体的可能性小于链状多价体。精原细胞染色体相互易位率随氚水剂量的增加而升高。小剂量范围内,剂量-效应关系表现为线性无阈的模式。生殖腺是辐射诱发基因突变和染色体畸变而引起遗传性缺陷所涉及到的很敏感组织。

Brooks等[22]给BNL小鼠饮用3×3.7×104Bq/mL氚水90～700 d，并在不同时间点取部分肝组织，观察肝细胞染色体畸变情况，结果发现，在330 d或500 d时，小鼠染色体损伤明显增加。

崔凤梅等[23]探讨氚水染毒后小鼠外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率的改变。小鼠腹腔单次注入氚水分别为1.85×105、5.55×105和16.65×105Bq/g，10 d后处死，结果发现，随着氚水初始注入量的增加，累积剂量也增加，骨髓嗜多染红细胞微核率相应增大，与对照组比较，差异均有统计学意义。小鼠腹腔单次注入5.55×105Bq/mL/g的氚水，分别于2、4、6、10和28 d处死小鼠，结果发现，氚水初始注入量相同，随注入后时间延长，累积剂量增大，骨髓嗜多染红细胞微核率持续增加，与对照组比较，自第4 d起差异均有统计学意义。给小鼠腹腔注入不同初始量的氚水, 2、4、6、10和28 d眼球摘除取血,处死后取两侧股骨,并计数外周血白细胞总数和骨髓嗜多染红细胞微核率。结果表明，骨髓嗜多染红细胞微核率不仅随氚水初始注入量的增大而增高，而且还随注入后时间的延长而增高，直到第28天仍未恢复到对照组水平。结果说明，氚水引起内照射损伤时，骨髓嗜多染红细胞微核可作为一个早期辐射损伤的灵敏指标，但仍然需要积累更多的剂量和时间分级的检测结果来估算其剂量-效应关系和时间-效应关系。

陈德清等[24]研究发现，小剂量HTO(氚水)进入体内能引起机体细胞产生对较大剂量电离辐射的适应性反应。小鼠腹腔注射3.7×102～3.7×105Bq/g HTO作为适应剂量，随后60Co γ射线全身照射1.5 Gy作为激发剂量，结果观察到3.7×103Bq/g组诱发的适应性反应最明显，同时在1～5 d内照射激发剂量1.5 Gy均可观察到适应性反应，以第5 d最为显著，观察值相当于预期值的50%。如果以适应性反应指数表示,激发剂量照射后24 h达最大值0.52。一次腹腔注射小剂量 HTO, 可引起小鼠骨髓细胞对随后一个较大剂量γ射线照射诱发的染色单体畸变率显著地低于预期值。

Ikuohima等[25]给 Hale toner SBrookhaven系小鼠饮用氚水 3×3.7×104Bq/mL，在之后的28～261天多次采集骨髓，制片，观察细胞增殖动力学和姐妹染色单体互换数。结果发现，81、163、192、247 和261天时姐妹染色单体互换数均有增加，并且随饮用氚水时间的延长而呈直线上升，与对照组相比差异显著。氚水也能使姐妹染色单体互换率(SCE)增加。

Roch-Lefevri等[26]对长期暴露于低剂量氚β粒子辐射的小鼠的细胞遗传学损伤进行分析，并将这些效应与等剂量γ射线照射产生的效应进行比较。给小鼠饮用水中加入氚化水(HTO)或有机结合的氚(OBT),HTO吸收剂量分别为0.009、0.9、18.3、0.0083、8.3、166 mGy；OBT吸收剂量分别为0.008、0.97、21.7、0.088、8.95、181.3 mGy。计算经氚作用后产生的β粒子的剂量率，并进行相同剂量全身外部γ照射，剂量率1.44 μGy/h和31 μGy/h，持续1或8个月。检测了骨髓和外周血淋巴细胞中的细胞遗传学损伤，以及其相对生物学效应(RBE)。氚和γ射线照射均未在骨髓中产生遗传毒性作用。

2.2 氚诱发大鼠染色体畸变

郭月凤等[27]给Wistar大鼠在妊娠第11 d单次腹腔注射适当浓度的氚水，大鼠体水氚的浓度分别为0.037、0.555和5.55 MBq/mL，8月龄仔鼠吸收剂量分别为0.012、0.189和1.89 Gy。检查各组8月龄仔鼠心脏血淋巴细胞染色体畸变。结果表明，各受照组仔鼠淋巴细胞染色体型畸变率、总畸变率、畸变细胞率都显著高于对照组；0.189和1.89 Gy两个剂量组间总畸变率、畸变细胞率差异显著。

邹淑爱等[28]使用40天龄SD大鼠，设2个实验组，自由饮用4.8×105Bq/mL和2.22×105Bq/mL浓度的氚水，对照组动物饮用自来水，直至自然死亡。取股骨骨髓涂片，计数嗜多染红细胞中的微核细胞率；取濒死状态的大鼠心脏血2～3 mL进行淋巴细胞培养，统计染色体畸变率。结果表明，平均微核细胞率高剂量组和低剂量组分别为(8.3±2.12)%和(4.95±1.85)%，对照组为(1.2±0.48)%，两剂量组间及两剂量组与对照组间差异显著。染色体观察结果表明，高剂量组和低剂量组分别为23.27%、4.96%，对照组为1.8%，两剂量组间及两剂量组与对照组间差异显著。并见到在一个细胞中染色体可有多个畸变。与骨髓嗜多染红细胞中的微核细胞率相比，心脏血淋巴细胞的染色体畸变率更高, 说明染色体对氚水更敏感。

3 氚诱发离体细胞染色体畸变的研究

3.1 细胞系

邹淑爱等[28]以中国仓鼠肺细胞克隆亚系 CHL-1作为实验用细胞，观察不同剂量的氚水诱发的CHL-1 细胞染色体畸变。把氚水加至细胞培养液中，细胞的辐射吸收剂量分别为0.022、0.044、0.088、0.176、0.264、0.44 Gy, 结果观察到主要是染色体型的畸变, 畸变细胞数及断裂数与剂量呈线性关系，Y畸变细胞数=4.4×10-2+1.2×10-2D，r=0.9746；Y断裂数=3.2×10-2+3.1×10-2D，r=0.9964。该实验同时用60Co γ射线诱发细胞染色体畸变作为对比效应，以CHL-1细胞的畸变细胞数和断裂数为生物终点时，氚水相对于60Co γ射线的相对生物效应分别为1.3和6.2。

3.2 人外周血染色体畸变

邓冰等[29]研究低剂量水平下氚水β射线的生物效应，将人体外周血分别与不同浓度的氚水(0.1～100 μL)混合，对照组加入同体积的0.9%的NaCl溶液，氚水活度4.65×108Bq/mL，剂量率0.024～1.230 mGy/min, 剂量范围0～1.8 Gy。分别培养24、48、72 h后收获细胞，计数染色体双着丝粒体，得到与氚水作用后染色体畸变的频率，以60Co γ射线照射后的细胞效应作为参照，得到相同剂量下氚水的相对生物效应值。结果发现，在剂量率一定时，随吸收剂量增加，各剂量点的双着丝粒体/细胞增加；在低剂量作用下，β射线诱发染色体畸变的能力比同剂量γ射线强。

张连珍等[30]研究发现，氚水β射线诱发人淋巴细胞染色体畸变研究中的氚水浓度为1.85×105Bq/mL，剂量率为0.00931 Gy/min，在37 ℃下照射不同时间，得到照射不同剂量的实验样品，其剂量范围为0～0.465 Gy。同时进行60Co γ射线平行实验，剂量率为0.01 Gy/min，细胞的吸收剂量范围为0～0.5 Gy。结果表明，氚β射线和60Co γ射线照射G0期人淋巴细胞诱发染色体畸变的剂量-效应关系均宜拟合为Y=a+bD模式，相关系数分别为0.9918和0.9257。以60Co γ射线为参考辐射,以淋巴细胞染色体畸变为生物终点, 测得氚的RBE值为2。

张秀珍等[31]研究报道，将人全血0.2 mL加入3.8 mL培养液中培养24 h，再加入不同浓度的3H-TdR和HTO，同时加入秋水仙素，继续培养到52～54 h收集，观察S 期、G2期淋巴细胞染色体单体型畸变。结果表明，每个细胞中染色单体断裂随剂量呈线性增加，染色体畸变的剂量-效应关系适宜以Y=aD+bD2表示。以60Co γ射线为参考辐射，HTO诱发人淋巴细胞双着丝粒体加着丝粒环的RBE值随β射线剂量的增加而降低，范围为1.4～2.6。

Hori等[32]把3H-TdR(10-3～102)×3.7×104Bq/mL和HTO (10-3～102)×3.7×104Bq/mL加入人淋巴细胞的培养液中培养48 h。结果表明，两者都可以使细胞的染色体发生畸变，而且畸变率与剂量相关。在高剂量时，畸变随剂量呈直线增加，但在低剂量时，明显高于所预测得的直线关系。

Prosser[33]做了相似的实验，并与250 kV X射线作了比较，测得的RBE值为1.13±0.18。若将大剂量70×3.7×107Bq/mL并作用20～150 min，使剂量达0.25～7 Gy，所得的结果包括细胞损伤率、有着丝点的环、无着丝点环和双着丝点的出现率都与剂量呈正相关。与X射线所致人淋巴细胞色体畸变数相比,在0.25 Gy时RBE2.6，剂量增大此值下降[34]。

Bocian等[35]研究了氚水或180 kV X射线对人外周血淋巴细胞染色体畸变的诱导作用。将淋巴细胞经不同浓度的HTO照射2 h或53 h。用植物血凝素刺激后的第一次有丝分裂期间对染色体和染色单体型畸变进行分析。结果表明，淋巴细胞经氚β射线和X射线照射后，双着丝粒+中心环、末端+间质缺失最适合线性二次函数。然而，暴露于HTO 53 h后这些类型的畸变数据给出了线性和线性二次函数的同样良好的拟合。线性模型给出了染色单体畸变的剂量-效应关系的曲线。在研究中发现与180 kV X射线相比，氚β射线的RBE为1.17±0.02。

Snigireva等[36]用人外周血淋巴细胞染色体畸变来评估氚的相对生物学效应，人外周血淋巴细胞经γ射线和氚β射线照射后，分析了外周血淋巴细胞中非稳定染色体畸变频率，并与60Co γ射线照射相比。结果表明，氚β辐射的RBE在最小剂量下确定为2.2，在1 Gy下降至1.25。比较两组专业核工作者(Sarov镇)在远程接触慢性氚β和γ辐射时稳定染色体畸变率，证明氚β辐射RBE为2.5。

3.3 人类离体精子染色体畸变

Kamiguchi等[37]使用人类精子和仓鼠卵母细胞的种间体外受精，研究了氚β射线对人类离体精子染色体的影响。用含有1.53～24.3 mCi/mL HTO的培养基处理精液样品约80 min。来自对照的1 290个精子和来自受照射组的1 842个精子进行核型分析。结果发现，染色体畸变的精子发生率随着剂量的增加呈线性增加；断裂型畸变的发生频率远高于易位；染色体型畸变的出现频率远高于染色单体型。所有这些类型的畸变都表现出线性剂量依赖性增加。计算HTO β射线相对于X射线的RBE值，当吸收剂量估计为最小值时，RBE值介于1.89至3.00之间；当吸收剂量估计为最大值时，RBE值介于1.04和1.65之间。

4 事故的剂量重建

Lioyd等[38]通过荧光原位杂交(FISH)技术对一名11年前因事故摄入氚水的病例进行的染色体易位分析。比较此方法与先前由尿液分析和双着丝粒染色体估算的剂量进行比较。

两个实验室共享血液淋巴细胞，每个实验室使用不同的染色体探针组合进行FISH分析。通过参考其中一个实验室建立的离体标准刻度曲线进行剂量估算。两个实验室测得的易位率非常一致。将易位率与事故后不久获得的双着丝粒频率进行比较，并且在暴露后6年测量的易位率显示所有测量之间有良好一致性，并且不会随时间的延长而有很大的变化。表明该个体在11年内易位是相当稳定的。用FISH方法测定经氚水照射后，对染色体易位率进行回顾性的剂量重建。结果显示，与初始双着丝粒分析和尿中氚测量估计的剂量一致。由于对接受均匀全身照射的个体进行了广泛的初始剂量测定，该病例是使用FISH测量易位率用于回顾性生物剂量的极好例证。

5 结语

氚水可以渗入细胞及细胞核内，照射处于各期的细胞，可产生染色体型畸变及染色单体型畸变。还参与DNA分子结构的构建，氚极易经呼吸、饮水、饮食及皮肤途径进入人体[39]并与细胞中的 DNA和RNA结合，直接产生辐照作用，并可诱发染色体畸变。DNA 对电离辐射非常敏感[40]，氚水中的氚易于与DNA 结合，从而导致生物体分子遗传毒性[41,42]。同时HTO在衰变过程中除了射线辐射作用外，3H衰变时产生的作用，会在衰变地址留下一个具有3He原子的分子，依赖于3He原子所在分子及其在分子中的具体位置，畸变可能比粒子的电离辐射更加危险[43]。

分析外周血淋巴细胞染色体异常在电离辐射领域已得到广泛应用，可作为“生物剂量计”估算事故情况下受照人员的辐射剂量，同时也是评价辐射远后效应的重要指标，在辐射致癌和遗传效应与染色体损伤关系方面有着重要的意义。随着核电的大力发展，氚向环境中排放量不断增加，氚对人类健康的影响越来越重要。对氚的生物学效应开展更深入的研究，结合分子生物学等有效的的手段，从分子水平加以研究，更全面和客观了解氚的生物学效应，为辐射防护提供数据支撑。