Wnt信号通路拮抗剂DKK-1在骨病及骨修复中的研究进展

陈金忠 黄建婷 谢克恭 唐毓金

【关键词】Wnt信号通路;DKK-1;DKK-1Ab;骨病;骨修复

中图分类号：R68 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.014

骨骼生长、建模、重塑决定骨骼的结构、质量和生物力学特性。成人的骨量稳态需要骨吸收和骨形成的精确平衡，当这种平衡紊乱后，可能导致骨质疏松症或骨折修复不良。这些年来，研究成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞在成骨和骨吸收的作用，一直是研究骨病的主题。骨髓来源的间充质干细胞（MSC）作为这些细胞的前体细胞，在分化的过程中受Wnt信号通路的调节。因此作为Wnt通路的抑制剂之一，DKK-1的表达可能与骨质疏松症、股骨头坏死和炎性骨病等疾病的发生发展息息相关。通过调控DKK-1的表达可能成为骨病及骨修复合成代谢疗法的新靶点。本综述目的是总结DKK-1在骨病及骨修复的研究进展和DKK-1单克隆抗体在治疗骨丢失及骨修复的潜在效用。

1 DKK-1的生物特性

DKK是一种细胞外蛋白，最早发现于无脊椎动物，包括四种不同的形式：DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4[1]。DKK-1表达于多种细胞、组织，是四种蛋白中研究最为广泛的形式，可抑制不同生物和细胞类型的Wnt/β-catenin信号通路。Wnt信号通路转导有经典与非经典途径，在多数研究中以经典途径为主。当Wnt蛋白与卷曲（FZD）受体家族结合形成Wnt-FZD复合物，Wnt-FZD复合物结合低密度脂蛋白相关蛋白（LRP5或LRP6），进而阻止糖原合酶激酶（GSK3）的磷酸化作用，增加细胞核内β-catenin与转录因子T细胞因子-4（TCF4）结合并增强靶基因表达。DKK-1与LRP5/6结合后，抑制Wnt-Fz-LRP5/6复合物的形成，从而抑制Wnt信号通路的传导[2]。最近的数据提供了关于LRP5/6在Wnt信号传导途经中额外信息，描述LRP5/6受体上不同的配体结合结构域，当DKK-1与LRP5或LRP6的第一个β螺旋桨结合后，抑制Wnt1类信号传导，LRP6的晶体结构证实LRP6的第三个螺旋桨基序结合DKK-1，但抑制的是Wnt3a类信号传导[3]。除此之外，DKK-1还与Kremen1和Kremen2蛋白结合。DKK-1与Kremens结合间接与LRP结合形成DKK-1-Kremen-LRP5/6三元复合物后被细胞内化，竞争抑制Fz-LRP5/6复合物的形成，从而抑制经典Wnt信号传导[4]。

2 DKK-1在骨病中的作用

2.1 DKK-1与骨质疏松

骨质疏松症主要特征是骨量、骨强度和微结构逐渐丧失，是全球常见疾病之一。过度调节的骨吸收或骨形成可导致原发性或继发性骨质疏松症，这个过程主要由成骨细胞和破骨细胞调节。增强成骨细胞分化、活性，抑制破骨细胞分化、活性，是Wnt信号通路调节骨量和维持合成代谢主要机制。DKK-1可以抑制成骨細胞分化、成熟，促进核因子KB配体（RANKL）和骨保护素（OPG）激活剂的表达，RANKL和OPG是负责调节破骨细胞分化的关键内源调节因子，增加RANKL/OPG比率可以提高破骨细胞活性，导致骨形成和骨吸收比例失调出现骨质流失[5]。Tian等[6]的研究证实DKK-1表达水平与RANKL/OPG比率呈正相关，这个发现提示DKK-1可能与骨形成无关，但与骨吸收有关。有学者提出DKK-1可能是炎症反应破坏性的潜在介质，其血清水平与骨吸收、炎症反应呈正相关，中和DKK-1可以预防炎症期间的骨质流失[7]。Butler[8]和Coulson[9]等在骨质疏松患者中发现血清DKK-1水平显著增高，并且与骨密度（BMD）密切相关，证实了DKK-1在骨量丢失中起着负调节作用。但Tian等[6]研究发现，除了绝经后骨质疏松妇女的血清DKK-1水平高于正常绝经妇女之外，并没有发现DKK-1与骨密度（BMD）呈负相关。另外，Voorzanger-Rousselot等[10]发现血清DKK-1水平和年龄之间无明显相关性，间接提示骨质疏松症本身的发病机制导致DKK-1水平增加，而不是因为衰老的原因。长期使用糖皮质激素后成骨细胞DKK-1表达上调，这可能是长期使用糖皮质激素引起骨质疏松症的机制之一[11]。用反义寡核苷酸（DKK-1-AS）敲除DKK-1的表达后，消除了地塞米松对前成骨细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素表达的抑制作用，并减轻了地塞米松对骨密度和骨小梁的影响[12]。以上的研究形成了DKK-1抑制骨形成同时促进骨吸收的概念，另外也解释DKK-1对骨的作用是通过抑制Wnt通路介导的，其直接损害新骨形成和有限的OPG表达，从而改变RANKL/OPG比率以促进骨吸收。

2.2 DKK-1与骨折的修复

骨折由高能量性创伤或脆性增加引起，代表了重大的公共健康问题。骨折不愈合或延迟愈合的发展受到细胞骨生成的局部能力降低影响，这与细胞衰老和DKK-1分泌增加有关[13]。在胫骨骨折的小鼠中发现高表达的DKK-1抑制骨折愈合，通过Wnt3a刺激Wnt信号传导可以促进小鼠骨折愈合[13]。相反，在动物模型中条件性敲除LRP5或β连环蛋白基因抑制Wnt信号传导，正常的骨修复被延迟;β连环蛋白基因被敲除后，DKK-1Ab在骨折修复中的作用减弱;未进行基因敲除的动物模型在皮下注射DKK-1Ab，骨折桥接得到改善，这也提示了DKK-1Ab通过作用于β-连环蛋白信号传导来增强骨修复[14～16]。另外，不论是重组DKK-1，还是DKK-1的腺病毒过表达，在小鼠骨折模型中都出现骨质愈合不良的反应[17]。在骨不连患者基质细胞中发现DKK-1处于高表达，表明DKK-1抑制Wnt信号通路传导后可能导致骨折延迟愈合甚至骨不连[13]。这些研究表明抑制DKK-1表达，激活Wnt信号通路的传导可以促进骨折修复，但DKK-1并不是在骨折所有阶段都起到相同的作用。研究中发现为保持成骨细胞终末阶段正常矿化，需要DKK-1和DKK-2上调[18]。过度激活Wnt/β-catenin后，小鼠的骨松质增加，但是骨的质量、刚度却下降[12]。这可能由于Wnt/β-catenin被过度激活后导致成骨细胞终末分化受损，矿化水平降低及胶原的量、排列紊乱使成骨原料质量下降，最终骨的质量、刚度下降。因此，Wnt/β-catenin信号通路的作用可能是阶段性的，DKK-1在骨折愈合过程（炎症期、修复期及重塑期）中呈现出不同的效应。DKK-1和硬化蛋白（sclerostin）在骨折中起到协同作用，为此Florio等[16]在Scl-Ab和DKK-Ab的结构基础上，设计出了靶向硬化蛋白和DKK-1的双特异性抗体促进骨折的愈合。因此DKK-1在骨折过程中可能起到某种关键偶联介质，单一调控DKK-1对骨折的影响可能有限，多种因子联合调控可能是未来的研究方向。

2.3 DKK-1与股骨头缺血坏死

股骨头坏死（ONFH）分为创伤性与非创伤性，非创伤性主要以激素性与酒精性多见。骨髓间充质干细胞向成骨细胞和成脂细胞分化异常，一直是多数学者研究股骨头坏死机制关注的领域。相关研究表明，激素性股骨头坏死与DKK-1抑制Wnt信号通路传导最终导致骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和成脂细胞比例失调密切相关[19]。Kato等人[20]在激素性股骨头坏死患者血清中检测出DKK-1水平高于正常对照组，并证明了长期暴露于糖皮质激素的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性较低，成骨分化能力以及骨再生能力下降，这些可能是高表达的DKK-1抑制Wnt信号通路所致。虽然酒精性股骨头坏死与DKK-1的报道不多，但Ko等人[21]分别检测16名激素性股骨头坏死和18名酒精性股骨头坏死患者的血清DKK-1丰度都显著高于股骨颈骨折组，同时DKK-1在股骨头坏死组织的骨细胞处于高表达状态。国内的学者李伟峰等[22]发现股骨头坏死患者血清DKK-1水平不仅与正常人有明显差异，同时与患者病情的进展、严重程度有密切关系，作为实验组的67例中有24例是酒精性股骨头坏死。许多研究揭示了股骨头坏死组织病理学中骨细胞死亡的高发生率，但是导致骨细胞凋亡的生物活性分子身份仍然不确定。敲除DKK-1消除了超生理糖皮质激素在动物模型中诱导的骨丢失和成骨细胞凋亡的作用，暗示DKK-1可能是一些骨骼疾病的致病因子。为此有学者提出设想，骨坏死中的骨细胞凋亡可能与DKK-1表达有关，并进行研究发现DKK-1与骨细胞中的促凋亡调节因子和程序性死亡调节因子的表达相关[23]。在股骨头坏死过程中，DKK-1可能通过抑制Wnt通路，作为股骨头坏死骨微观结构恶化的细胞凋亡促进因子，从而促进病变中细胞凋亡活动。但是负责促进股骨头中DKK-1表达的分子机制尚不清楚，缺血、氧化应激和机械负荷都可能是促进DKK-1表达的理化因素。

2.4 DKK-1与其他相关骨疾病

除了上文陈述的疾病之外，近些年文献报道DKK-1可能是炎症性关节炎中骨和关节病理改变的影响因素。与健康对照者相比，DKK-1在滑膜成纤维细胞表达增强，并且在类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）患者的血清增加，部分研究也支持血清DKK-1水平升高可能与关节破坏和骨损伤有关[24～26]。与发生骨侵蚀的RA相比，强直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）患者血清DKK-1浓度高于健康对照组，但与骨化呈负相关，与疾病活动性并无明显相关[27]。后续的研究发现DKK-1的下调可能导致成纤维细胞增殖和成骨增加，过表达导致相反的效果[28]。有人在膝关节骨性關节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）的患者中发现膝关节滑液DKK-1水平高于健康对照组，并且结合影像表现发现DKK-1水平与KOA关节损伤的严重程度呈正相关，与RA、AS不同的是，KOA患者血清DKK-1水平与健康组相比，并未发现有明显差异[29]。在诸如此类的炎症性骨病中，DKK-1可能起到炎症介质的作用。研究中发现，DKK-1抗体可预防骨质侵蚀，促进骨赘形成，然而并不影响炎症;除此之外，在急性、慢性炎症中DKK-1出现升高的现象[7，30]。DKK-1在慢性炎症性疾病中介导骨侵蚀的潜在相关性已扩展到系统性红斑狼疮、银屑病关节炎等疾病的研究[31～32]。尽管如此，DKK-1在这些疾病中的作用机制尚需要进一步研究。在炎性关节内抑制DKK-1活性导致最易受炎症诱导骨侵蚀的部位形成骨赘，提示 DKK-1可能是炎症与骨丢失偶联的关键分子，而这与上文描述DKK-1在骨质疏松作用机制一致。

3 DKK-1Ab在骨丢失及骨修复的潜在作用

许多研究已经证实，使用DKK-1Ab抑制DKK-1的活性，可以减少骨量的丢失促进骨折的修复。给幼龄的卵巢切除（OVX）小鼠单次施用DKK-1Ab后，腰椎和下肢的骨密度（BMD）增加;此外，骨量少且雌激素缺乏的小鼠，每周用20 mg/kg的DKK-1Ab治疗8周后，腰椎和股骨的BMD恢复到正常水平[33]。与性腺完整的幼鼠和雌激素缺乏小鼠结果不同的是，DKK-1Ab并未在骨质减少的成年OVX大鼠起到相似作用[34]。而这可能是DKK-1在成年大鼠和幼龄小鼠中表达的差异所致，最终导致DKK-1Ab在这些研究中出现功效差异。横向胫骨骨折的模型小鼠用DKK-1Ab处理后，发现骨痂机械强度增加，机制可能是促进β-连环蛋白信号传导，激活软骨内骨化增强骨折修复[15]。虽然DKK-1Ab可以促进骨折的修复，但作用机制及作用时段尚未清楚。Komatsu等[35]报道在骨折后立即注射DKK-1Ab能够促进骨折的修复，但在第4天注射并没有明显的效果，这提示DKK-1Ab促进骨折修复作用可能在骨折愈合的早期阶段。Witcher等人[36]发现同时使用骨硬化蛋白抗体和DKK-1Ab产生的协同作用远远超过单一种抗体，且沉默骨硬化蛋白后，DKK-Ab具有高效骨合成代谢作用，对此他们得出的结论是DKK-1Ab通过阻止骨硬化蛋白上调增加骨量。在骨骼修复中，可能存在多种调节剂来限制骨形成。硬化蛋白和DKK-1可能通过阻断LRP5/6与特异性Wnt结合，或者结合Wnt信号通路下游信号而具有某些冗余功能。而阻断这两种蛋白质可能进一步增加了Wnt信号传导，从而对骨形成和修复产生更强大的作用。

4 展望

源于人类遗传学观察结果使人们对Wnt信号分子与骨形成之间的关系有了深刻的理解，并为骨骼疾病的新型合成代谢疗法的发展开辟了一个激动人心的新时代。Wnt信号通路中的受体-配体、抑制剂-配体相互作用在骨代谢调节中的研究，为深入探讨骨病发病机制以及骨修复寻求更好的合成代谢疗法提供了机会。正如本文所述，DKK-1作为Wnt通路的抑制剂可能参与诸多疾病的发生发展，正成为合成代谢疗法的主要新靶点。且单克隆抗体DKK-1Ab对DKK-1的抑制已经证明在骨疾病的各种动物模型中具有增加骨形成、骨量和骨强度的功效。但目前的文献只是强调DKK-1Ab的短期效应;如果要将这些分子开发为长期临床治疗药物，则需要更长时间的研究来证明这些分子的长期疗效和安全性，包括骨质量和癌症风险的评估。

參 考 文 献

[1]Bafico A，Liu G，Yaniv A，et al.Novel mechanism of Wnt signalling inhibition mediated by Dickkopf-1 interaction with LRP6/Arrow[J].Nature Cell Biology，2001，3（7）：683-686.

[2]Tian E，Zhan F，Walker R，et al.The Role of the Wnt-Signaling Antagonist DKK1 in the Development of Osteolytic Lesions in Multiple Myeloma[J].New England Journal of Medicine，2003，349（26）：2483-2494.

[3]Ke HZ，Richards WG，Li X，et al.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases[J].Endocrine Reviews，2012，33（5）：747-783.

[4]Mao B，Wu W，Davidson G，et al.Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta catenin signalling[J].Nature，2002，417（6889）：664-667.

[5]Guo X，Tang P，Liu P，et al.DKK1：A promising molecule to connect Alzheimer's disease and osteoporosis[J].Medical Hypotheses，2016，88：30-32.

[6]Tian J，Xu Xiao J，Shen L，et al.Association of Serum DKK-1 Levels with β-catenin in Patients with Postmenopausal Osteoporosis[J].Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences），2015，35（2）：212-218.

[7]Mazon M，Larouche V，St-Louis M，et al.Elevated blood levels of Dickkopf-1 are associated with acute infections[J].Immunity，inflammation and disease，2018，6（4）：428-434.

[8]Butler JS，Murray DW，Hurson CJ，et al.The role of DKK1 in bone mass regulation：Correlating serum DKK1 expression with bone mineral density[J].Journal of Orthopaedic Research，2011，29（3）：414-418.

[9]Coulson J，Bagley L，Barnouin Y，et al.Circulating levels of dickkopf-1，osteoprotegerin and sclerostin are higher in old compared with young men and women and positively associated with whole-body bone mineral density in older adults[J].Osteoporos Int，2017，28（9）：2683-2689.

[10]Voorzanger-Rousselot N，Journe F，Doriath V，et al.Assessment of circulating Dickkopf-1 with a new two-site immunoassay in healthy subjects and women with breast cancer and bone metastases[J].Calcified Tissue International，2009，84（5）：348-354.

[11]Hurson CJ，Butler JS，Keating DT，et al.Gene expression analysis in human osteoblasts exposed to dexamethasone identifies altered developmental pathways as putative drivers of osteoporosis[J].Bmc Musculoskeletal Disorders，2007，8：12.

[12]Chen Y，Whetstone HC，Lin AC，et al.Beta-catenin signaling plays a disparate role in different phases of fracture repair： implications for therapy to improve bone healing[J].Plos Medicine，2007，4（7）：e249.

[13]Bajada S，Marshall MJ，Wright KT.Decreased osteogenesis，increased cell senescence and elevated Dickkopf-1 secretion in human fracture non union stromal cells[J].Bone，2009，45（4）：726-735.

[14]Kim JB，Leucht P，Lam K，et al.Bone regeneration is regulated by wnt signaling[J].Journal of Bone & Mineral Research，2010，22（12）：1913-1923.

[15]Jin H，Wang B，Li J，et al.Anti-DKK1 antibody promotes bone fracture healing through activation of β-catenin signaling[J].Bone，2015，71：63-75.

[16]Florio M，Gunasekaran K，Stolina M，et al.A bispecific antibody targeting sclerostin and DKK-1 promotes bone mass accrual and fracture repair[J].Nature Communications，2016，7：11505.

[17]Minear S，Leucht P，Jiang J，et al.Wnt Proteins Promote Bone Regeneration[J].Science Translational Medicine，2010，2（29）：29-30.

[18]Lu C，Xing Z，Yu YY，et al.Recombinant human bone morphogenetic protein-7 enhances fracture healing in an ischemic environment[J].Journal of Orthopaedic Research，2010，28（5）：687-696.

[19]岳辰，张雪，温阳阳，等.siRNA慢病毒载体介导DKK-1基因沉默对骨髓间充质干细胞分化影响的实验研究[J].中华骨与关节外科杂志，2018，11（2）：137-142，150.

[20]Kato T，Khanh VC，Sato K，et al.Elevated expression of DKK-1 by glucocorticoid treatment impairs bone regenerative capacity of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].Stem Cells & Development，2018，27（2）：85-99.

[21]Ko JY，Wang FS，Wang CJ，et al.Increased Dickkopf-1 expression accelerates bone cell apoptosis in femoral head osteonecrosis[J].Bone，2010，46（3）：584-591.

[22]李伟峰，陈立新，陈哓俊，等.血清Dickkopf-1蛋白在早期诊断股骨头坏死及病情监测中的意义[J].中国现代医学杂志，2018，28（35）：43-47.

[23]Bruggink KA，Kuiperij HB，Gloerich J，et al.Dickkopf-related protein 3 is a potential Aβ-associated protein in Alzheimer's Disease[J].Journal of Neurochemistry，2015，134（6）：1152-1162.

[24]Santos AM，Saldarriaga EL，Giraldo-Bustos R，et al.Dickkopf 1 protein circulating levels as a possible biomarker of functional disability and chronic damage in patients with rheumatoid arthritis[J].Clinical Rheumatology，2017，37（3）：795-801.

[25]Seror R，Boudaoud S，Pavy S，et al.Increased Dickkopf-1 in Recent-onset Rheumatoid Arthritis is a New Biomarker of Structural Severity.Data from the ESPOIR Cohort[J].Scientific Reports，2016，6：18421.

[26]Passalent LA，Kang R，Lawson D，et al.THU0644-HPR E-Learning： An Effective Method To Improve Disease Knowledge and Self-Efficacy for Patients with Axial Spondyloarthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases，2016，75（Suppl 2）：1272.

[27]田麗贞，杜红卫，童爱飞，等.DKK-1在强直性脊柱炎患者外周血中的表达及临床意义研究[J].中国全科医学，2017，20（z1）：131-133.

[28]Zou YC，Yang XW，Yuan SG，et al.Downregulation of dickkopf-1 enhances the proliferation and osteogenic potential of fibroblasts isolated from ankylosing spondylitis patients via the Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro[J].Connective Tissue Research，2016，57（3）：200-211.

[29]Theologis T，Efstathopoulos N，Nikolaou V，et al.Erratum to： Association between serum and synovial fluid Dickkopf-1 levels with radiographic severity in primary knee osteoarthritis patients[J].Clinical Rheumatology，2017，36（8）：1933.

[30]Pinzone JJ，Hall BM，Thudi NK，et al.The role of Dickkopf-1 in bone development，homeostasis，and disease[J].Blood，2008，113（3）：517-525.

[31]Fassio A，Idolazzi L，Viapiana O，et al.In psoriatic arthritis DKK-1 and PTH are lower than in rheumatoid arthritis and healthy controls[J].Clinical Rheumatology，2017，36（10）：2377-2381.

[32]Mabille C，Witrand AR，Degboe Y，et al.DKK1 and sclerostin are early markers of relapse in multiple myeloma[J].Bone，2018，113：114-117.

[33]Glantschnig H，Scott K，Hampton R，et al.A Rate-Limiting Role for Dickkopf-1 in Bone Formation and the Remediation of Bone Loss in Mouse and Primate Models of Postmenopausal Osteoporosis by an Experimental Therapeutic Antibody[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2011，338（2）：568-578.

[34]Li XD，Grisanti M，Fan W，et al.Dickkopf-1 regulates bone formation in young growing rodents and upon traumatic injury[J].Journal of Bone & Mineral Research，2011，26（11）：2610-2621.

[35]Komatsu DE，Mary MN，Schroeder RJ，et al.Modulation of Wnt signaling influences fracture repair[J].Journal of Orthopaedic Research，2010，28（7）：928-936.

[36]Witcher PC，Miner SE，Horan DJ，et al.Sclerostin neutralization unleashes the osteoanabolic effects of DKK1 inhibition[J].JCI Insight，2018，3（11）：e98673.

（收稿日期：2019-05-27 修回日期：2019-06-22）

（編辑：潘明志）