PPAR受体色谱模型的构建及在小分子肽筛选中的应用研究

侯亚妮 王辉 刘荣利

摘      要：过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）在核激素受体中起着非常重要的作用。PPRA有许多亚型，其γ亚型（PPARγ）是控制内分泌代谢的。通过实验的方法论证了PPAR受体在小分子肽筛选中的作用。选择人参总皂苷、人参皂苷和大黄提取物作为实验对象，以验证不同筛选方法的可行性。使用人参总皂苷和大黄提取物在自制的生物柱上分析实验中的试剂。实验结果表明，总人参皂苷和大黄提取物具有作用于PPARγ的成分。

关  键  词：过氧化物酶体增殖物激活受体;生物色谱法;人参总皂苷;大黄提取液

中图分类号：O 657.7⁺2        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2019）11-2481-04

Construction of PPAR Receptor Chromatography Model and

Its Application in Screening of Small Molecule Peptides

HOU Ya-ni， WANG Hui， LIU Rong-li

（School of Medicine， Xian Peihua University， Shaanxi Xian 710025， China）

Abstract： Peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR） is a very important member of the medical community and plays a very important role in nuclear hormone receptors. There are many subtypes of PPRA， and its gamma subtype （PPARγ） is a key factor in controlling endocrine metabolism. In this paper， the role of PPAR receptors in the screening of small peptides was demonstrated by experimental methods. The ginseng total saponins， ginsenosides and rhubarb extracts were selected as experimental subjects to verify the feasibility of different screening methods. The reagents in the experiments herein were analyzed on a homemade biocolum using ginseng total saponins and rhubarb extracts. The experimental results showed that the total ginsenoside and rhubarb extract had components acting on PPARγ

Key words： Peroxisome proliferator-activated receptor; Biochromatography; Ginseng total saponins; Rhubarb extracts

眾所周知，受体是人体内一类重要的蛋白质，参与体内的许多生理生化反应，调节生理功能，且是许多药物的作用靶点^[1，2]。在目前上市的药物中，许多药物均是作用于PPARγ受体而发挥疗效的，所以PPARγ受体是生命科学与药物领域研究的热点。受体生物色谱是将试剂均匀地分布在色谱的相表面，其用于试剂与受体之间的互相作用，从而可以得到试剂在各个不同点位的作用强度等特点，同时利用受体与试剂的这种特性可以建立一种高效、迅速、稳定的筛选方法^[3]。

1  PPAR受体

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）^[4-6]在医学研究中起着非常重要的作用。它在核激素受体中起着非常重要的作用^[7]。在治疗各种疾病中可以作为潜在的靶点发挥作用，同时其对于一些比较难治的疾病起到了调节的作用。

国内外基于应用组合化学肽库技术筛选小分子肽都有过很多介绍^[8，9]。庞秀枰等^[10]使用“一个珠子和一个肽链”的化学肽文库技术的组合，通过对肺癌细胞的研究挑选出了我们现在使用比较广泛的氨基酸库。并且在实验过程中得到了与肺癌细胞紧密联系的小分子肽结构。此外，许芳等^[11]以不同形式的生物素作为样本标记小分子肽，实验结果表明小分子肽能够作为很好的识别体去反应肺癌细胞的临床效果。

2  PPAR受体色谱模型的构建

2.1  生物色譜法

PPARγ色谱法的原理是通过一个特定的受体固定在载体上，然后用我们常用的分析方法挑选出试剂。通过待筛选的试剂在静止期的行为去推断试剂与PPARγ是否结合。与上述方法相比，生物色谱法不需要纯度更高的单体，筛分活性成分更简单，更快速，更可重复。

生物色谱法中，最重要的是选择一个合适的材料。在众多材料中首选硅胶，因为硅胶作为实验材料，它能表现出很好的机械强度，同时，它的表面积相对其他实验材料来说也更大。不过硅胶表明的极性基团对于受体的活性会产生一定的影响。为了解决这一问题，刘嘉君等^[12]通过实验分析提出了细胞膜的色谱法。细胞膜色谱法和生物色谱法类似，都是通过一个特定的受体固定在载体上，只是细胞膜的载体换成了硅胶。两者都能确定我们试验所使用的载体和细胞膜的受体之间的关系。

2.2  受体色谱的特点

受体色谱结合了受体和色谱技术的优点，故其具有高灵敏度、高稳定性等特点。现今医学研究中，已有很多学者将药物与受体之间的特异性的能力作为筛选试剂的有效方法^[13]。受体色谱的概念结合了受体和色谱之间的特性，有效地扩展了色谱的研究范围，使人们能够更加清楚地了解色谱的特性。

受体色谱与以往的色谱技术相比，存在以下的优势：首先，受体色谱是通过特定的方式固定载体，能够很好地确保实验试剂的效果;其次，受体色谱的载体—硅胶具有很多的稳定性能，能够重复利用，易于出现理想的实验结果;最后，色谱方法可用于梳理、调节和优化固定受体的构象和方向，以最大化体内受体-药物的相互作用。可用于中药复杂系统中药物-受体相互作用的高效、靶向筛选和快速分析。本文建立了系列受体色谱模型（图1）。

3  PPAR受体色谱模型的应用

PPAR作为很多疾病的靶向细胞有着得天独厚的效果。从目前人们研制出来的各个治疗糖尿病的药品来看，大部分都具有一定的毒副作用，现在急需一种能够安全、有效的针对糖尿病的PPARγ制剂。在我国中医已成为一种重要的方式来缓解人们的疾病。由于中医大都选用的是纯天然的草药，其毒副作用很小，现在市面上出售的很多治疗糖尿病的天然药物都参考了中医的特性。但是，由于其中很多都没有经过特定的实验，并且实验人员的素质参差不起，缺乏药理知识，导致真正发挥天然草药的药品还很少。通过研究发现，人参皂苷、栀子、大黄等都可以作为治疗糖尿病的优选中药，但是这些中草药怎么发挥其药效的还没有得到很好的验证。

3.1  实验仪器

本节所用仪器如表1所示。

3.2  实验试剂

本节所用试剂如表 2所示。

3.3  实验内容

在实验过程中，制备人参总皂苷溶液，注射体积为12 μL，检测波长为200 nm。流速为0.25 mL/ min，色谱柱的设计温度为25 °C，流动相为乙腈-水（18/90，V/ V），连续实验3次。观察总人参皂苷在自制生物柱上的结果。

收集自制生物柱上的人参总皂苷的保留组分并通过HPLC-MS分析。本实验采用负离子监测模式，源极的注入电压为-4.6 kV，离子源温度为280 ℃，雾化气体为N₂。碰撞气体为Ar，注入体积为12 μL，检测波长为200 nm，流速为0.3 mL /min，柱温为25 ℃。 流动相为甲醇-水（80/20，V/V）。

称取0.2 g粉状榛子粉（100目筛），放置与提前准备好的消毒烧杯中，用适量 57%的甲醇提取 15 min，取出实验后的溶液静置，待15 min之后冷却至室内的温度。

以12 μL的注射体积，230 nm的检测波长和0.2 mL/min的流速注射榛子提取物溶液。柱的设计温度为25 ℃，流动相为Tris-EDTA-MgCl₂。

3.4  实验结果与讨论

自制生物柱上人参总皂苷的色谱图如图2所示。色谱图是方框中的部分。通过图2可以看出：人参皂苷中有一定的活性成分与受体PPAR 相关。保留的成分将通过HPLC-MS进行分析。

通过对总人参皂苷进行实验分析可以发现：Re 的总离子流图与总人参皂苷的保留成分基本一致（如图3所示）。

通过对大黄的实验分析发现：大黄的提取液在色谱柱上有着很明显的区别。大黄在PPARγ柱有着正常的表现，但是其在负柱上基本没有成本留下。实验结果表明：在实验中注入大黄的提取液，其会产生一种成分作用于试剂上，与PPARγ类似（如图4所示）。PPARγ生物色谱柱的稳定性如图5所示。实验结果显示，生物色谱柱对实验试剂的保留性逐渐减小。

4  PPAR受体的小分子肽筛选

目前，有两种常用的筛选小分子肽的方法： 一种是“一个珠子和一个肽链”的组合化学肽库，另一个是噬菌体展示肽库方法。

1991年，林教授首次提出了“一珠一肽链”的化学肽库技术，“建立”原则是在树脂珠上随机合成天然和非天然氨基酸，根据实验需要可以合成不同长度和构象（环状或线性）的肽链，例如4、6和8个氨基酸。每个珠子上只有一条肽链，通过这种筛选方法可以筛选出实验所需的样本，并且筛选出来的样本的成功率极高。除了组合化学肽方法，实验中还可以用到噬菌体展示方法。由于噬菌体在筛选蛋白质的过程中不能保证筛选出来的蛋白质的稳定性，故对于筛选小分子肽人们普遍选用组合化学肽方法。

5  结束语

本文通过实验的方法论证了PPAR受体在小分子肽筛选中的作用。实验选取了人参总皂苷、人参皂苷、大黄提取液作为实验对象，验证了不同的筛选方式的可行性。实验结果表明，总人参皂苷和大黄提取物具有作用于PPARγ的成分。

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