双重氧化还原敏感的生物可降解聚合物胶束的制备及表征

张学全 李赛 张漫 万诗雨

摘      要：以胱胺為引发剂，L-天冬氨酸4-苄酯内酸酐（BLA-NCA）和L-苯丙氨酸内酸酐（Phe-NCA）为单体通过开环聚合方法合成聚氨基酸共聚物（ASP（Z）），经氢溴酸脱保护得到侧链带羧基的氧化还原敏感响应的聚氨基酸共聚物（ASP-COOH），再将氧化还原敏感响应的喜树碱（CPT-SS-OH）小分子药物键合到聚合物侧链，得到双重氧化还原敏感响应的生物可降解两亲性聚合物，核磁共振氢谱（HNMR）和傅里叶红外光谱（FTIR）结果表明成功的合成了目标分子。通过两亲性高分子的自组装形成胶束，动态光散射（DLS）和扫描电子显微镜（SEM）对胶束的粒径及分布、zeta电位和微观形貌进行表征。结果发现，两亲性聚合物可形成球形结构胶束，粒径为（233.23±7.90）nm，zeta电位为（-21±1.10）mV。同时，胶束在生理条件下稳定，在谷胱甘肽（GSH）存在条件下，双重氧化还原敏感胶束结构“崩解”。设计的双重氧化还原敏感胶束可用于响应肿瘤的微环境而实现快速药物释放。

关  键  词：双重氧化还原敏感;氨基酸;聚合物胶束;谷胱甘肽

中图分类号：TQ 317         文献标识码： A       文章编号：1671-0460（2019）11-2459-05

Preparation and Characterization of Biodegradable Polymer

With Dual-redox-response

ZHANG Xue-quan， LI Sai， ZHANG Man， WANG Shi-yu

（College of Chemical Engineering， Sichuan University， Sichuan Chengdu 610065， China）

Abstract： The polyamino acid copolymers （ASP（Z）） were synthesized by ring-opening polymerization with cysteamine as initiator， L-Aspartic acid 4-benzyl ester NCA （BLA-NCA） and L-Phenylalanine NCA （Phe-NCA） as monomers. After deprotection with hydrobromic acid， a redox-sensitive copolymer with carboxyl groups （ASP-COOH） was obtained， and then the redox-sensitive response camptothecin （CPT-SS-OH） was bonded to the polymer side chain to obtain a dual-redox-sensitive biodegradable amphiphilic polymer. The results of 1H NMR and FTIR showed that the target product was successfully synthesized. The micelles were formed by self-assembly of amphiphilic polymers， and the particle size and distribution， zeta potential and micromorphology of micelles were characterized by dynamic light scattering （DLS） and scanning electron microscopy （SEM）. The results showed that the amphiphilic polymer can form spherical structural micelles with a particle size of （233.23±7.90）nm and a zeta potential of （-21±1.10）mV. At the same time， the micelles are stable under physiological conditions， and the double redox-sensitive micelle structure "disintegrated" in the presence of glutathione （GSH）. Therefore， the dual-redox-sensitive micelles designed herein can be used to achieve rapid drug release under the tumor microenvironment.

Key words： Dual-redox-response; Amino acid; Polymer micelles; Glutathione

癌症（cancer）是一种严重威胁全球人类健康疾病之一^[1]。目前用于癌症治疗的方法有手术、化疗、放疗、免疫治疗、基因治疗等^[2-4]。随着对肿瘤的深入研究和发现，肿瘤区域的生理环境与正常组织相比有很大的不同，如肿瘤细胞的快速增殖和旺盛的代谢行为导致了高还原性环境^{[5， 6]}、低pH^{[7， 8]}、高度表达酶^{[9， 10]}等。基于肿瘤微环境设计的的纳米药物载体，不仅能解决纯化疗药物带来的全身毒性，还能实现对药物的精确可控释放。

聚氨基酸由于其优良的生物可降解性和生物相容性，已被广泛地用于药物递送系统^[11-13]。此外，聚氨基酸侧链上丰富的活性官基团，如天冬氨酸具有羧基基团（-COOH）^[14-17]、赖氨酸具有氨基基团（-NH2）^{[15， 18]}，这为聚氨基酸功能化改性提供了位点。

因此，基于肿瘤微环境，我们选用了人体中必需的两种a-氨基酸作为聚合单体（L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸4-苄酯），引入具有还原敏感性的二硫键，通过开环聚合制备出生物可降解的聚氨基酸，经氢溴酸脱保护反应，获得了侧链带羧基（-COOH）官能团的聚天冬氨酸，通过在侧链上键合氧化还原敏感响应的喜树碱（CPT-SS-OH），构建两亲性聚合物。采用透析法制备聚合物胶束在氧化还原敏感环境下聚合物中的二硫键可发生断裂，胶束崩解，释放化疗药物喜树碱。

1  实验部分

1.1  试剂与仪器

胱胺二盐酸盐、L-天冬氨酸4-苄酯、喜树碱购置于希恩思科技生化科技有限公司;L-苯丙氨酸购置于探索平台;二氯甲烷（CH2Cl2）、四氢呋喃（THF）、正己烷、二甲基亚砜、无水乙醚、三乙胺（TEA）、无水硫酸镁等试剂均为分析纯，购置于成都市科龙化工试剂厂;三光气、氢溴酸（33%乙酸溶液）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）购置于安耐吉化学有限公司;还原性谷胱甘肽（GSH）购置于阿达玛斯试剂有限公司;透析袋购置于美国Spectrum公司;2-羟乙基二硫化物购置于Sigma-Aldrich。

Bruker 400MHz核磁共振波谱仪、傅里叶红外光谱仪（FTIR）、动态光散射仪（Malvern Zetasizer Nano ZS）、场发射扫描电镜（Hitachi S-4800，Japan）。

1.2  聚合物的合成

双重氧化还原敏感响应的生物可降解聚氨基酸的合成路线如图1所示。

1.2.1  合成L-天冬氨酸4-苄酯内酸酐（BLA-NCA）和L-苯丙氨酸内酸酐（Phe-NCA）

准确称量12.5 g L-天冬氨酸4-苄酯于250 mL支口瓶内，抽真空和氮气置换三次后，加入80 mL重蒸THF;准确称量21.6 g三光气，并用重蒸THF溶解后于恒压滴定漏斗中缓慢滴入。整个反应体系于50℃下恒温反应，反应3h后溶液变澄清，停止反应。使用旋蒸系统除去大部分THF后，将其加入无水正己烷溶剂中，反复沉淀三次后，抽滤，将得到的滤饼于常温真空干燥，即可得到白色粉末状L-天冬氨酸4-苄酯NCA单体（BLA-NCA）。L-苯丙氨酸NCA（Phe-NCA）的合成方法过程如上所述。

1.2.2合成带二硫键的聚苯丙氨酸和天冬氨酸共聚物ASP

称量6 g胱胺二盐酸盐溶解于20 mL 超纯水中，再逐滴加入2.132 g NaOH水溶液;室温搅拌反应1 h，二氯甲烷萃取三次，无水硫酸镁干燥，浓缩，真空干燥得到胱胺。称取1.950 3 g Phe-NCA和2.542 3 g BLA-NCA单体置于圆底烧瓶中，氮气氛围下加入100 mL重蒸CH₂Cl₂，搅拌分散均匀后，加入0.08 g胱胺，于35 ℃条件下搅拌反应3 d后，旋蒸浓缩、乙醚沉淀、过滤并真空干燥后得到带保护共聚物。称取3 g该共聚物于圆底烧瓶中，三氟乙酸充分溶解后，分3次加入5 mL氢溴酸溶液，搅拌反应3 h后，加入大量乙醚沉淀，过滤得到的沉淀使用去离子水溶解后，转移至截留分子量为3 500透析袋中，于超纯水中透析4 d，冷冻干燥即可得到白色产物即带羧基的氨基酸共聚物ASP。

1.2.3  合成氧化还原敏感喜树碱（CPT-SS-OH）

参照文献^[19]的方法合成还原响应性CPT，具体步骤如下所述：称取CPT 2.0和0.8 g三光气于支口瓶中，在氮气氛围下，加入150 mL无水二氯甲烷，磁力搅拌下使其分散均匀。称取2.6 g DMAP，无水二氯甲烷将其溶解，置于恒压滴定漏斗中，缓慢滴入支口瓶中，滴加完毕后，溶液變澄清，继续搅拌30 min。随后将10 g 2-羟乙基二硫化物溶于无水四氢呋喃中，并缓慢滴加到反应瓶中，室温下搅拌反应24 h。反应结束后，使用150 mL 0.1 M HCl溶液反复洗3次，然后依次使用饱和食盐水和去离子水清洗一次。采用无水硫酸镁将通过分液得到的有机层进行干燥除水，过滤得到有机相，旋蒸浓缩，氯仿/甲醇（3：10/v：v）重结晶，常温真空干燥即可得到CPT-SS-OH。

1.2.4  合成CPT-ASP

称取0.5 g ASP和0.44 g CPT-SS-OH于圆底烧瓶中，氮气保护，加入25 mL DMSO使材料溶解，将0.34 g DCC和4‰ASP质量的DMAP用DMSO溶解，再转移至恒压滴定漏斗中缓慢滴入到圆底烧瓶中，常温反应48 h。反应结束后，选用截留分子量为3 500的透析袋透析2 d，冷冻干燥后得产物CPT-ASP。

1.3  双重氧化还原敏感響应的聚合物胶束制备

采用透析法制备双重氧化还原敏感聚合物胶束，具体步骤如下：称取7.5 mg CPT-ASP材料，使用300L色谱纯DMSO溶解后，将该溶液逐滴滴入到剧烈搅拌的13 mL去离子水中，常温搅拌过夜，然后将该溶液转移至截留分子量为2 000的透析袋中，去离子水进行透析，每2 h更换一次水，直至溶剂透析完后后，将溶液从透析袋中转移出来，定容至15 mL，超声后，使用离心机进行离心（3 500 r/min，5 min），收集上层溶液即可得到胶束溶液。

1.4 双重氧化还原敏感响应胶束的粒径及形貌测试

使用动态光散射仪对胶束粒径及分布和zeta电位进行测试。测试温度为25℃，分散介质为水，折射系数为1.33。采用扫描电镜对胶束的微观形貌进行表征，样品制备方法如下：将10L胶束溶液滴于硅片上，静置，待水分自然挥干后用于形貌观察。

1.5  双重氧化还原敏感响应胶束还原敏感性测试

常温下，将胶束溶液分别在GSH浓度为0 mM、5和10 mM条件下孵育，孵育30 min 后，使用动态光散射仪对胶束的粒径及分布、zeta电位进行检测，同时使用扫描电镜对胶束在GSH孵育前后进行了微观形貌观测。

2  结果与分析

2.1  双重氧化还原敏感响应的聚合物表征

首先，采用三光气合成了两种a-氨基酸内酸酐（NCA）单体，再通过开环聚合和脱保护的方法获得了策略带官能团的氨基酸共聚物，在侧链化学键合氧化还原响应的喜树碱，构建双重氧化还原敏感响应的两亲性高分子，具体合成步骤见图1所示。

2.1.1  BLA-NCA和Phe-NCA单体结构表征

通过FTIR表征BLA-NCA单体，结果如图2B所示。在3 310和1 862 cm^-1处出现了N-H（-CO-NH-）的伸缩振动和环酸酐中羰基的吸收峰，且在1 786和1 727 cm^-1附近出现了酰胺键的羰基特征吸收峰，说明成功的合成了BLA-NCA单体。在Phe-NCA的FTIR图中（图2A），同样出现了形成内酸酐上两个特征羰基吸收峰（1 836.28和1 777.68 cm^-1）。特征峰的出现，可知两种a-氨基酸均与三光气发生了反应，成功合成了对应的NCA单体。

2.1.2  CPT-SS-OH和CPT-ASP的结构表征

CPT-SS-OH的核磁氢谱图结果如图3所示，在d=4.38（a）和d=3.91（d）出现了酯键和羟基端相邻的两个亚甲基质子峰;同时在d=2.75～3.06出现了与二硫键相邻的四个氢质子峰，d=1.02归属于喜树碱上的甲基质子峰，且质子峰的积分比例与理论相符，说明成功合成了氧化还原敏感响应的喜树碱（CPT-SS-OH）。

双重氧化还原敏感响应的聚氨基酸共聚物和喜树碱改性的共聚物的核磁氢谱结果如图4所示。如图4A所示，脱去盐酸的胱胺引发BLA-NCA和Phe-NCA开环聚合后，在d=7.0～7.5之间，出现了苄氧羰基和苯丙氨酸上苯环的质子峰，同时d=4.0～4.8归属于两种氨基酸a碳原子上的质子峰。当经过氢溴酸脱保护反应后，d=7.0～7.5之间苯环的质子峰的比例下降和d=5.02处质子峰的消失，说明苄氧羰基的成功脱去（图4B）。当将CPT-SS-OH键合在聚氨基酸共聚物侧链上后，位于d=7.0附近的苯环质子峰比例增加，且CPT-SS-OH中与羟基相邻的亚甲基质子峰由于酯化反应，移向了高场d=1.7。说明了喜树碱改性的聚氨基酸共聚物成功合成。

2.2  双重氧化还原敏感响应的聚合物胶束粒径及形貌表征

使用动态光散射仪和扫描电镜对制备的双重氧化还原敏感响应胶束的粒径及分布、zeta电位和微观形貌进行了表征。如图5所示，制备的胶束粒径大小为（233.23±7.9）nm，电位为（-21±1.1）mV。同时从扫面电镜的结果图中可以看出，制备的胶束呈球形（如图6所示），说明合成的两亲性聚合物可以在水中自组装成纳米结构的胶束，且粒径大小和表面的负电荷利于血液长循环且通过EPR效应到达肿瘤部位，实现药物的高效递送。

2.3  双重氧化还原敏感响应的聚合物胶束的还原敏感性表征

采用扫描电子显微镜和动态光散射仪对双重氧化还原敏感响应的聚合物胶束粒径和形貌进行表征，结果如表1和图6所示。

在GSH还原条件下，胶束粒径都急剧增大，分散系数也同样增大，zeta电位从负变为正，特别是在10 mM GSH浓度下，zeta电位增加到（17.3±0.50）mV。此外，我们对10 mM GSH孵育后的胶束形貌进行表征，结果如图6所示。在与GSH孵育30 min后，胶束溶液出现了大量肉眼可见絮状沉淀物，通过对溶液的上清液进行微观形貌表征，可以发行大量的纳米粒子结构被破坏，说明在氧化还原条件下，二硫键发生断裂，造成了胶束结构崩解。

3  結论

本文通过开环聚合和缩合反应成功地合成了双重氧化还原敏感响应的生物可降解两亲性聚氨基酸，核磁氢谱和红外光谱证明成功的合成了目标聚合物。合成的聚合物在水溶液中可自组装形成分散均匀的球形结构、表面带负电荷的纳米胶束，且在氧化还原条件下（GSH）聚合物中二硫键断裂破坏胶束结构，导致胶束崩解。因此，基于此类双重氧化还原敏感响应的聚合物胶束可实现在血液中长循环，到达肿瘤组织或细胞中更快地释放药物，实现高效的肿瘤治疗。

参考文献：

[1]BRAY F， FERLAY J， SOERJOMATARAM I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA： A Cancer Journal for Clinicians， 2018，68（6）：394-424.

[2]VOICULESCU V M， LISIEVICI C V， LUPU M， et al. Mediators of Inflammation in Topical Therapy of Skin Cancers[J].Mediators of inflammation， 2019，2019：8369690.

[3]FARHOOD B， MORTEZAEE K， GORADEL N H， et al. Curcumin as an anti-inflammatory agent： Implications to radiotherapy and chemotherapy[J].Journal of Cellular Physiology， 2019，234（5）：

5728-5740.

[4]BREEDVELD S， CRAFT D， van HAVEREN R， et al. Multi-criteria optimization and decision-making in radiotherapy[J].European Journal of Operational Research， 2019，277（1）：1-19.

[5]MA J， DENG H， ZHAO F， et al. Liposomes-Camouflaged Redox-Responsive Nanogels to Resolve the Dilemma between Extracellular Stability and Intracellular Drug Release[J].Macromolecular Bioscience， 2018，18（7）：1800049.

[6]GHASSAMI E， VARSHOSAZ J， TAYMOURI S. Redox Sensitive Polysaccharide Based Nanoparticles for Improved Cancer Treatment： A Comprehensive Review[J].Curr Pharm Des， 2018，24（28）：3303-3319.

[7]RABIEE S， TAVAKOL S， BARATI M， et al. Autophagic， apoptotic， and necrotic cancer cell fates triggered by acidic pH microenvironment[D]. Journal of Cellular Physiology， 2019， 234 （7）： 12061-12069.

[8]DUONG H T T， THAMBI T， YIN Y， et al. Smart pH-Responsive Nanocube-Controlled Delivery of DNA Vaccine and Chemotherapeutic Drugs for Chemoimmunotherapy[J].ACS Applied Materials & Interfaces， 2019，11（14）：13058-13068.

[9]IA X， ZHANG Y， ZOU Y， et al. Dual Intratumoral Redox/Enzyme-Responsive NO-Releasing Nanomedicine for the Specific， High-Efficacy， and Low-Toxic Cancer Therapy[J].Advanced Materials， 2018，30（30）：1704490.

[10]BRUUN J， LARSEN T B， J?LCK R I， et al. Investigation of enzyme-sensitive lipid nanoparticles for delivery of siRNA to blood-brain barrier and glioma cells[J].International journal of nanomedicine， 2015，10：5995-6008.

[11]ABBAS M， ZOU Q， LI S， et al. Self-Assembled Peptide- and Protein-Based Nanomaterials for Antitumor Photodynamic and PhotothermalTherapy[J].Advanced Materials， 2017，29（12）：1605021.

[12]ZAGORODKO O， ARROYO-CRESPO J J， NEBOT V J， et al. Polypeptide-Based Conjugates as Therapeutics： Opportunities and Challenges[J].Macromolecular Bioscience， 2017，17（1）：1600316.

[13]GUPTA B， RUTTALA H B， POUDEL B K， et al. Polyamino Acid Layer-by-Layer （LbL） Constructed Silica-Supported Mesoporous TitaniaNanocarriers for Stimuli-Responsive Delivery of microRNA 708 and Paclitaxel for Combined Chemotherapy[J].ACS Applied Materials & Interfaces， 2018，10（29）：24392-24405.

[14]TIAN L， TAO L， LI H， et al. Hollow mesoporous carbon modified with cRGD peptide nanoplatform for targeted drug delivery and chemo-photothermal therapy of prostatic carcinoma[J].Colloids and Surfaces A： Physicochemical and Engineering Aspects， 2019， 570： 386-395.

[15]LIN W， MA G， YUAN Z， et al. Development of Zwitterionic Polypeptide Nanoformulation with High Doxorubicin Loading Content for Targeted Drug Delivery[J].Langmuir， 2019，35（5）：1273-1283.

[16]RAHMATOLAHZADEH R， HAMADANIAN M， MA MANI L， et al. Aspartic acid functionalized PEGylated MSN@GO hybrid as an effective and sustainable nano-system for in-vitro drug delivery[J]. Advances in Medical Sciences， 2018，63（2）：257-264.

[17]KOSS K M， UNSWORTH L D. Towards Developing Bioresponsive， Self-Assembled Peptide Materials： Dynamic Morphology and Fractal Nature of Nanostructured Matrices[J].Materials （Basel， Switzerland）， 2018，11（9）：1539.

[18]Z董銳， 郑雪琴， 唐兰勤. 聚乳酸-氨基酸共聚物的合成及表征[J].当代化工， 2009，38（06）：559-562.

[19]WANG Y， WEI G， ZHANG X， et al. A Step-by-Step Multiple Stimuli-Responsive Nanoplatform for Enhancing Combined Chemo- Photodynamic Therapy[J]. Advanced Materials， 2017， 29 （12）： 1605357.