甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因序列分析

刘吴鑫，马博妍

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

甘南牦牛是主要产于我国3 000～5 000 m 的高山、亚高山地区草原上的一种特有家畜，主要分布在甘肃省甘南藏族自治州，为当地牧民提供肉、乳、毛等生产生活必需品，在遗传资源上是一个极为宝贵的基因库。线粒体DNA(mtDNA)是细胞核外遗传物质，主要以母系遗传方式遗传，可以作为研究物种起源进化和重建物种系统发育树的遗传标记手段[1]。线粒体 DNA 细胞色素 b（cytochrome b, Cytb） 基因是线粒体蛋白质编码基因中结构功能研究最为透彻的基因，尤以进化速度较快为特点，在昆虫遗传进化研究中已有较多的应用[2-3]。因此，线粒体DNA也可用于甘南牦牛高原环境适应性等方面的研究[4]。本研究采用DNA池和直接测序法预获得甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因全序列，从分子水平分析其理化性质，旨在为我国牦牛的起源、遗传多样性等研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘肃省夏河县屠宰场采集甘南牦牛血样75份，医用采血管保存。采用传统的苯酚-氯仿抽提法进行基因组DNA提取，去离子水溶解稀释。牦牛DNA母液各取5μL构建DNA混合池，-20℃冷冻保存备用。

1.2 引物设计

依据Gen Bank公布的普通牛mtDNA Cytb基因序列（No：NC_006853），利用Primer6.0和Lasergene软件设计一对特异性引物扩增DNA混合池。引物序列：F∶5’-CCATAAATAGGTGAAGGTTTCG-3’，R∶5’-TTGATGGTGAGACTGCAGTT-3’，并送至苏州金唯智生物有限公司进行合成。

1.3 PCR扩增和克隆测序

PCR扩增体系总体积为40 μL：DNA模板2.0 μL，0.25μmol·L-1上下游引物各1.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 22.0 μL，双蒸水14.0 μL。PCR 扩增程序为 ：95 ℃ 预变性4 min ；95 ℃ 变性30 s，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存，1%琼脂糖凝胶对扩增结果进行检测。PCR产物经凝胶回收试剂盒回收纯化后送至苏州金唯智生物有限公司进行双向测序，测序结果用DNA Star软件比对和拼接获得甘南牦牛mtDNA Cytb基因序列。

1.4 牦牛mtDNA Cytb基因序列分析

甘南牦牛mtDNA Cytb基因理化性质分析依据参考文献[5]介绍的在线软件进行。

2 结果与分析

2.1 甘南牦牛mtDNA Cytb基因PCR扩增及测序结果

甘南牦牛mtDNA Cytb基因PCR扩增检测结果如图1所示，扩增片段大小为1 401 bp，与预期扩增片段相符，电泳条带清晰，特异性良好。

图1 牦牛mtDNA Cytb基因引物扩增产物的琼脂糖检测

2.2 甘南牦牛mtDNA Cytb基因编码氨基酸组成分析（图2）

获得扩增片段长度为1 401 bp，利用NCBI的ORF Finder程序预测获得甘南牦牛mtDNA Cytb 编码区1 140 bp 的开放阅读框（ORF），起始密码子ATG，终止密码子AGA，推测甘南牦牛mtDNA Cytb基因编码379个氨基酸残基组成的蛋白质。牦牛编码产物mtDNA Cytb基因分子质量约为98.5 KD，理论等电点为4.98。20种氨基酸组成中，半胱氨酸(Cys)占全部氨基酸组成的1.1%(4个)，亮氨酸（Leu）占全部氨基酸组成的15.8%(60个)。整个蛋白带正电荷，其中正电荷30个，负电荷17个。碱性氨基酸18个，酸性氨基酸40个，非极性氨基酸215个，疏水性氨基酸182个。氨基酸残基中负电荷残基总数（Asp+Glu）为17，正电荷残基总数（Arg+Lys）为18。分子式为C3555H5972N1140O1429S343，不稳定指数为31.23。甘南牦牛mtDNA Cytb基因序列中，A、T、G、C碱基含量分别为31.23%、13.42%、25.26%和30.09%。A+T含量为56.49%，明显高于G+C含量（43.51%）。AT偏倚度为0.1056，GC偏倚度为-0.3831。

图2 甘南牦牛mtDNA Cytb蛋白氨基酸组成预测

3 讨论

基因通过蛋白质决定生物的性状。蛋白质理化性质分析表明：甘南牦牛线粒体DNA Cytb编码蛋白由379个氨基酸残基构成；分子式为C3555H5972N1140O1429S343，分子质量较大（98.5KD），理论等电点为4.98。依据氨基酸分值越高疏水性越强，相反亲水性越强的原则，推测甘南牦牛线粒体DNA Cytb编码蛋白属于亲水性蛋白；不稳定指数值小于40(31.23)，表明该编码蛋白较稳定。20种氨基酸组成中，营养价值最高的亮氨酸（Leu）数目最多为60个，对蛋白质空间结构发挥重要作用的半胱氨酸（Cys）数目最少为4个，说明甘南牦牛线粒体DNA Cytb编码蛋白质中的半胱氨酸高度保守。正电荷残基为30个，负电荷残基为17个，表明甘南牦牛线粒体DNA Cytb编码蛋白质带正电。氨基酸残基中负电荷残基总数（Asp+Glu）为17，正电荷残基总数（Arg+Lys）为18。

甘南牦牛线粒体DNA Cytb基因序列中，碱基A平均含量最高（31.23%），碱基T平均含量最低（13.42%）。A+T含量（56.49%）高于G+C含量（43.51%），存在明显的AT使用倾向性，这一特征符合大部分哺乳动物线粒体DNA AT含量偏高的论点。AT偏倚度为0.1056，GC偏倚度为-0.3831，这与蔡欣等[6]的研究结果不一致。蔡欣等[7]研究发现我国普通牛线粒体Cytb基因表现出碱基组成偏好（0.45）以及平均整体AT含量最高（56.7%）。这可能是由于甘南牦牛与普通牛生活地域的差异导致二者在Cytb基因序列上的不同，这与甘南牦牛高原低氧适应性是否有关还得进一步进行探究。