稀释液中添加不同抗氧化剂对鸡精液保存的影响

李 洁，董瑞生，王建福，杨 洋，虎 啸，杨 祯，张永娥

（甘肃农业大学 动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070）

人工授精技术广泛应用于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽养殖行业，精液的保存已成为人工授精技术中的重要环节，使得精液的保存和应用不再完全依赖时间、地域、种畜生命的限制。随着现代科学技术的不断发展更新，牛的人工授精技术几乎全部采用冷冻精液来完成，而猪、羊、鸡的精液保存绝大部分使用常温（20～25℃）和低温（2～5℃）保存方法。

随着现代养禽业的快速发展，鸡人工授精技术得到广泛应用。而鸡精液的稀释与保存是人工授精技术发展的重要环节，能影响人工授精技术的好坏，该技术水平的高低直接影响优良种公鸡的利用效率和养鸡生产的经济效益。精液只有经稀释处理后，才能进行有效的保存和运输，有利于优秀种公鸡的资源共享。影响鸡精液体外低温保存效果的因素很多，如稀释液的渗透压、pH值、组成成分、鸡精液的稀释比例、保存温度等（张兆旺，2005）[1]。在上述诸因素中稀释液的组成成分直接影响以单细胞存在的精子的存活，以及鸡精子体外低温保存时的存活时间及保存后的受精力(胡日查，王玉宝等，1992)[2]。低温保存精液可以延长精子在体外的存活时间，维持其受精能力，有利于长途运输，扩大精液的使用范围。

陈阮明等[3]在国内率先开展了鸡精液体外低温保存效果的研究，设计出的“北京家畜精液稀释液（BJJX）”具有配置成份简单、低温保存效果良好等优点，在国内养鸡业中得到推广应用。因此，在鸡精液的常温或低温保存技术中，如何延长精液的保存时间以扩大和提高优良种畜禽利用率就显得极其重要（姚希芳，2002；张守权，2002）[4，5]。精液保存过程中，精子容易受伤，这与精子表面质膜被氧化的程度有关（陈阮明，廖纪朝等，2011）[6]。有试验研究维生素C、维生素C钠、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸四种抗氧化剂对鸡精液保存的影响发现，通过向鸡精液稀释液中添加N-乙酰半胱氨酸可以有效延长鸡精液的保存时间，在鸡精液稀释液的保存过程中主要对精子表面的质膜起到保护作用，从而可以保护精子（胡艳梅，白银山等，2002）[7]。对于在精液稀释液中添加维生素C、N-乙酰半胱氨酸来提高精液品质在猪和绵羊上已有研究和不同程度的应用（任峻岭，2007；任峻岭，2012）[8-10]，但在鸡上还没有相关研究。

本试验对低温下（2～5℃）保存的鸡精液稀释液通过添加不同浓度的维生素C、维生素C钠、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸作为抗氧化剂保存，对试验效果进行分组研究，以期找到能延长鸡精液保存时间的方法，以便在实际生产中可以明显提高优良种公鸡的利用效率、提高养鸡业生产的经济效益。

1 试验准备

基础配方设计、准备试验材料及化学药品、稀释液渗透压的理论计算、申请实验室等。

2 试验材料

2.1 公鸡精液

AA+白羽肉用型种公鸡精液。

2.2 试验仪器及用具

生物显微镜、万分之一电子天平、冰箱、温度计、恒温水浴锅、烘箱、容量瓶、烧杯、pH精确试纸、移液枪、载玻片、盖玻片、离心管、移液管等。

2.3 化学药品

维生素C、维生素C钠、褪黑素、N-乙酰半胱氨酸、果糖、L-谷氨酸钠、柠檬酸钾、乙酸钠、氯化镁。

3 试验方法

配置1 000 ml基础稀释液，分装为24组（维生素C、维生素C钠各6个梯度，褪黑素、N-乙酰半胱氨酸各5个梯度，2个对照组），每组20 ml，各组分别添加不同浓度的四种抗氧化剂。

采集鸡新鲜精液20 ml，用30组稀释液按1∶3比例稀释（每组用1.5 ml稀释液稀释0.5 ml精液，混合均匀后分为4个重复样），在低温（2℃～5℃）下保存，每天3次观测并记录精子活率，直至最后一个精子死亡，最后进行数据统计分析。

4 预试验

4.1 基础稀释液配置

基础稀释液配方（g/1 000 ml）：果 糖（C6H12O6）1 g、L-谷氨酸钠（C5H8NO4Na·H2O）1.92 g、柠檬酸钾(K3C6H5O7·H2O)1.28 g、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)8.5 g、 氯 化 镁(MgCl2·6H2O)0.68 g，按照配方配制基础稀释液1 000 ml。[11]

4.2 分组及添加抗氧化剂

按表1中4种抗氧化剂不同的浓度进行配置，包括一个对照组，每个分组加入20 ml稀释液溶解，然后保存到溶液瓶中，水浴锅沸水消毒30 min，冷却后加抗菌素保存。

4.3 鸡精液采集与稀释保存

从临洮县华加牧业公司采集新鲜鸡精液20 ml,置于20℃左右的保温杯中，经历3 h的运输后带回实验室，立即进行分组稀释。

表1 四种抗氧化剂不同浓度分组（单位：mmol/L）

4.4 精子存活率观测

将稀释保存的精液取样在生物显微镜下观测精子存活率并记录（取样时应迅速，保证保存精液温度变化不大），观测结果如表2所示。

精子存活时间为检查间隔时间的总和；精子生存指数指相邻两次精子存活率均数与间隔时间乘积的总和。从表2可知，维生素C和维生素C钠的添加量过高，会导致pH值、渗透压等变化过大而使精子死亡。

表2 精子生存指数和存活时间

5 正试验

5.1 稀释液配制（见表3）

基础稀释液的理论计算渗透压为411 mOsm/L，用精密pH试纸测得基础稀释液的pH值为6.5。按照上述基础稀释液配方，计算出1 000 ml基础稀释液所要的各种化学试剂的量，称量并置于100 ml的烧杯中，用蒸馏水溶解，定容在1 000 ml的容量瓶中，加入抗生素庆大霉素20万IU/L。根据预试验结果调整四种抗氧化剂至表4所示的浓度。

表3 基础稀释液配方

5.2 精液采集及稀释

精液采集：10月7日从临洮县华加牧业公司采集新鲜鸡精液20 ml,置于20℃左右的保温杯中，在最短的时间内带回实验室（从精液采集到分组稀释经历3 h的运输过程）。

精液稀释：按1∶3的比例稀释（精液1∶稀释液3），即0.5 ml鸡精液+1.5ml稀释液，混匀，分为4个重复放入冰箱中保存，温度控制在2～5℃。

5.3 精子存活率观测

每天3次取样，在显微镜下观测精子存活率并记录，详见表5。

本次试验分两次进行，AB为第一次试验，CD为第二次试验，其中两次试验对照组生存时间及生存指数有很大差异，说明本试验误差很大。

图1 添加维生素C组精子的存活时间和生存指数变化

表4 正试验四种抗氧化剂不同浓度分组（单位：mmol/L）

表5 精子存活时间和生存指数

图2 添加维生素C钠组精子的存活时间和生存指数变化

图3 添加褪黑素组精子的存活时间和生存指数变化

图4 添加N-乙酰半胱氨酸组精子的存活时间和生存指数变化

从图1至图4可看出：A组（维生素C）在0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L浓度下低温保存的存活时间没有明显变化，之后随浓度的增加而降低；生存指数对照组明显高于试验组，而且生存指数随着浓度的增大而降低。

B 组（维生素C钠）在0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 浓度下低温保存的存活时间没有明显变化，在2 mmol/L、4 mmol/L 浓度下存活时间明显低于对照组；生存指数在0.5 mmol/L浓度下与对照组差异不大，在2 mmol/L、4 mmol/L 浓度下明显低于对照组。

C组（褪黑素）的存活时间曲线呈谷峰式波动，0.003 mmol/L浓度下存活时间较长，说明该浓度对鸡精液低温保存时间有延长作用，但浓度高于0.003 mmol/L时出现抑制作用；生存指数随浓度增加呈先升后降趋势，0.001 mmol/L对鸡精液低温保存有积极作用，添加的褪黑素随浓度增加对鸡精液保存有一定抑制作用。

D组（N-乙酰半胱氨酸）精子的保存时间在 0.25 mmol/L 浓度下最长达220 h，0.5 mmol/L后随着浓度的增加呈下降趋势；生存指数在0.25 mmol/L、0.5 mmol/L 浓度下相对较高，随着浓度的继续增加，精子的生存指数逐渐降低，0.5mmol/L时精子生存指数有明显的提高。

6 讨论与分析

6.1 维生素C和维生素C钠

陈宗明，密国辉等（2012）[12]研究表明稀释液中添加维生素C能显著提高精子活力，提高精液品质，Mustafa等［13］研究发现，在羊精液低温保存时，稀释液中的维生素C含量低于200 μg/ml对精子活力无明显影响，当添加浓度达到500～1 000 μg/ml时，可显著延长精子的存活时间。本试验结果表明，稀释液中添加了抗氧化剂维生素C和维生素C钠的试验组与未添加抗氧化剂的对照组的精子存活时间、精子生存指数等没有明显差异，这与上述陈宗明，密国辉等的试验结果不一致。可能的原因有：试验中Vc及Vc钠浓度设计不合理，试验过程操作不熟练，导致试验误差太大。

6.2 褪黑素

褪黑素（melatonin，mlT）在医学领域具有抗氧化等方面的生理功能，可以保护细胞的膜脂质、蛋白质、核酸和其他成分[14]。经李博玲等试验研究发现，0.25 mg/ml褪黑素可以显著提高精子的活率、活力、线粒体活性及顶体完整性[15]。本试验所得结论 ：0.001 mmol/L、0.003 mmol/L、0.009 mmol/L、0.027 mmol/L、0.081 mmol/L 浓度比较中，0.003 mmol/L对鸡精液保存有明显作用，但随浓度增加对鸡精液保存有一定抑制作用。

6.3 N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸与H2O2、OH-、次氯酸等的结合可以明显降低细胞中活性氧自由基浓度，以保护细胞内生物大分子免受活性氧（ROS）引起的氧化性损伤［16］。通过向稀释液中添加带巯基物质可抵抗这种氧化压力，对保护精子质膜及抑制精子获能等有重要作用[17]，从而降低精子氧化代谢速度。魏世宝（2007）[10]研究发现在冷冻稀释液中添加1 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸可显著地提高解冻后精子的活率和顶体完整率，降低精子的低渗膨胀百分率，邱自贵（2016）[18]研究表明在稀释液中添加N-乙酰半胱氨酸可以极显著延长鸡精液低温保存时间，与该试验结果相近，即添加0.25 mmol/L、0.5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸可以明显提高精子生存指数及延长精子的存活时间，但浓超过1 mmol/L则不利于精子生存指数和存活时间的提高。