阿尔泰金莲花浸膏粉对PM 2.5致大鼠急性肺损伤的保护作用

陈文龙，由淑萍，赵 军，张 杰，刘 涛，*

（1.新疆医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学护理学院基础护理教研室，新疆 乌鲁木齐830011；3.新疆药物研究所维吾尔药重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011；4.新疆医科大学公共卫生学院中心实验室，新疆 乌鲁木齐830011）

随着我国工业及经济的迅速发展，细颗粒物（PM2.5）引起的居民健康问题得到了广泛关注。PM2.5是指空气动力学直径≤2.5μm的颗粒物，可被吸入人体肺部进入血液循环，导致心血管、呼吸系统疾病发病率及病死率增加[1-2]。据研究显示[3]，PM2.5对呼吸系统的损害主要集中在早期炎性损伤阶段，即急性肺损伤（acute lung injury，ALI），它是由呼吸系统急性炎症所致的临床常见的急性重症综合征[4]。金莲花又名旱金莲，是毛莨科金莲花属草本植物，其中金莲花属中的阿尔泰金莲花是新疆哈萨克医学特色药材，具有清热解毒、止血止咳等功效[5-6]，据相关研究[7-8]证实其主要活性物质为黄酮类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等活性。本研究采用PM2.5诱导的大鼠急性肺损伤模型，观察阿尔泰金莲花浸膏粉（Trollius altaicus extract powder，TAEP）对肺损伤模型大鼠血清生化指标、细胞因子以及肺病理组织学的影响，探究金莲花防治呼吸系统炎症的药效价值，为推进中药现代化及研发防治PM2.5所致急性肺损伤的药物或保健食品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

阿尔泰金莲花于2016年8月在新疆阿勒泰地区采集，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为毛莨科金莲花属阿尔泰金莲花。经回流提取法，料∶液比为1∶20，70%乙醇于100℃回流提取两次，每次1 h，过滤后，合并滤液浓缩得到TAEP，出膏率33.9%（每克浸膏粉相当于2.95 g阿尔泰金莲花）[9-10]。经高速逆流色谱分离纯化TAEP，发现其主要活性成分为黄酮类化合物，使用前需用0.5%羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose，CMC）-钠溶解配制成设定剂量受试物溶液。生理盐水、1%戊巴比妥钠和4%多聚甲醛（广州赛国生物科技有限公司），地塞米松磷酸钠注射液（河南润弘制药股份有限公司），LDH试剂盒、NO试剂盒、GSH试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；TNF-αELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、IL-1βELISA试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

微电脑大流量采样器KB-1000型（青岛金仕达电子科技有限公司），恒温水浴锅HH-501型（常州万合仪器制造有限公司），离心机TDL-40C型（上海安亭科学仪器厂），全自动血细胞分析仪BC-5000 Vet型（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），全自动酶标仪（美国BIORAD公司），紫外分光光度计（日本岛津仪器公司）。

1.2 PM2.5采集与制备

2017年11月—2018年3月，于新疆乌鲁木齐市某教学楼楼顶及某区疾病预防控制中心楼顶采样，架设采样仪器后，将捕获膜毛面向上置于切割器中固定，再将采样膜毛面向上固定在切割器下方的孔板中，流量设定为100 L/min，每采样105 min，间隔15 min，每片膜放置24 h，含尘面对折后密封袋封装放置于-80℃低温冰箱保存，雨雪天停止采样。采集结束后将滤膜剪为1 cm×2 cm大小，置于双蒸水中，超声震荡（40 Hz）40 min×3次，6层无菌纱布过滤，滤液经4 000 r/min离心10 min，收集底部沉淀置于玻璃平皿中，封口膜封口后扎细密小孔，-80℃低温冰箱过夜冷冻后真空干燥24 h，取得呈黑灰色的絮状PM2.5，保存于-20℃冰箱待用。使用时将干燥后的PM2.5粉末溶于蒸馏水，经玻璃棒搅拌后使用旋涡混匀器混匀，在使用前用超声清洗机超声震荡混匀，并略微加热，配制成相应悬液。

1.3 实验动物与实验方法

SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，购自新疆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2016-0003，实验动物使用许可证号：SYXK（新）2016-0002。饲养环境：温度22～24℃，湿度30%～50%，12 h/12 h昼夜交替。

大鼠适应性饲养3 d后随机分为正常对照组，模型组，TAEP 125、250、500 mg/kg剂量组，地塞米松（2 mg/kg）阳性对照组，每组10只。正常对照组和模型组给予相同体积的蒸馏水，其他各组按设定剂量灌胃给予受试物，连续给药30 d，阳性对照组在造模前1 h灌胃给予2 mg/kg地塞米松。第30天灌胃后2 h，除正常对照组滴注相同体积的生理盐水外，其余各组均采用预实验确定的气管滴注法向大鼠气管内缓慢注入PM2.5溶液14 mg/kg，造成大鼠急性肺损伤，造模3 h后，经大鼠腹主动脉取血，取1 mL全血于全自动血细胞分析仪进行白细胞分类及计数，其余血样于4℃、1 500 r/min离心15 min，分离上清液，待测；将5 mL PBS缓慢注入大鼠左肺分3次（2 mL、1.5 mL、1.5 mL）进行肺泡灌洗，20～25 min内完成，混合3次灌洗液使用离心机于4℃，1 500 r/min离心15 min，收集上清液，分装后保存于-80℃超低温冰箱中待测；取大鼠右肺上叶用甲醛固定，做病理组织学检查，取右肺下叶，用滤纸擦干表面水分后称质量，锡箔纸包裹后于恒温鼓风干燥箱80℃干燥48 h，剥离锡箔纸后称其干质量，计算肺大鼠右肺下叶湿质量（W）/大鼠右肺下叶干质量（D）比值。

为了明确TAEP对PM2.5致急性肺损伤大鼠肺组织病理分级，我们根据Roderick等[11]于1997建立的病理学分级标准，将肺损伤状况分为0～Ⅳ级（分级标准如表1所示）。

表1 ALI病理学评分标准

每剂量组选取8张病理切片，每片镜下分别截取2张200倍及400倍彩图照片，基于肺泡上皮细胞损伤程度，炎性细胞浸润程度，以及肺泡壁增厚程度等病理指标进行评分，评分过程中严格采用双盲法进行病理分级。

1.4 检测指标

1.4.1 血清生化指标检测 使用相应试剂盒检测大鼠血清LDH、NO、GSH、SOD、MDA含量，用相应ELLSA试剂盒检测大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量，检测环节及操作严格按照说明书进行。

1.4.2 BALF生化指标检测 使用相应ELLSA试剂盒检测大鼠肺泡灌洗液（bronohoalveolar lavage fluid，BALF）中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，检测环节及操作严格按照说明书进行。

1.4.4 组织病理学观察 取右肺上叶用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（厚度4～6μm）后HE染色，光学显微镜下观察其病理变化。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据以xˉ±s表示，采用单因素方差分析，LSD进行组间比较，检验水准α=0.05，等级资料采用多组独立样本秩和检验Kruskal-Wallis检验。

2 结果

2.1 TAEP对PM2.5致ALI大鼠白细胞分类计数的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠白细胞（WBC）、淋巴细胞（LYM）、中性粒细胞（NEUT）计数均升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）；与模型组比较，TAEP各剂量组及地塞米松阳性对照均能显著降低ALI大鼠WBC及NEUT计数（P均＜0.05），TAEP 500 mg/kg组及阳性对照组可降低ALI大鼠LYM计数（P均＜0.05）；与 125 mg/kg组比较，TAEP 250、500 mg/kg组WBC计数降低（P均＜0.05），500 mg/kg组LYM及NEUT计数降低（P均＜0.05），组间呈现一定的剂量-效应关系（r=0.36，P=0.02）；TAEP 500 mg/kg组抑制炎症细胞效果接近于地塞米松阳性对照组（P均＞0.05）。见表2。

表2 TAEP对PM2.5致ALI大鼠白细胞分类计数的影响（×109/L，n=10，±s）

表2 TAEP对PM2.5致ALI大鼠白细胞分类计数的影响（×109/L，n=10，±s）

与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与TAEP 125 mg/kg 组比较，#P＜0.05.

分组正常对照组模型组TAEP组剂量/（mg/kg）--地塞米松组125 250 500 2白细胞计数3.41±0.37 7.62±0.79△△6.73±0.38△△*5.51±0.08△△*#4.91±0.79△△**#4.35±0.23△△**淋巴细胞计数0.87±0.11 2.86±0.67△△2.64±0.14△△2.42±0.69△△1.86±0.14△△*#1.49±0.22△△*中性粒细胞计数1.75±0.51 4.33±0.32△△3.45±0.34△△*3.16±0.25△△*2.77±0.41△△**#2.20±0.57△△**

2.2 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清及BALF中细胞因子的影响

见表3。与正常对照组比较，模型组大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）；与模型组比较，TAEP各剂量组及地塞米松组干预可降低大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量（P均＜0.05或0.01）；与125 mg/kg组比较，250 mg/kg组血清和BALF中IL-1β含量降低（P均＜0.05）；与250 mg/kg组比较，500 mg/kg组血清和BALF 中IL-1β、IL-6、TNF-α含量降低（P均＜0.05），组间呈一定剂量效应关系（r=0.52，P=0.04）；TAEP 500 mg/kg组血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α含量与地塞米松阳性对照组接近，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表3 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清及BALF中细胞因子的影响（pg/mL，n=10s）

表3 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清及BALF中细胞因子的影响（pg/mL，n=10s）

与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与125 mg/kg TAEP组比较，#P＜0.05；与250 mg/kg TAEP组比较，##P＜0.05.

分组正常对照组模型组TAEP组剂量（mg/kg）血清BALF--地塞米松组125 250 500 2 IL-1β 62.19±7.89 85.31±4.11△△83.34±6.345△△77.47±5.14△△*#72.33±3.87△△**##68.43±4.61△**IL-6 676.98±8.56 864.33±3.83△△812.49±3.41△△*788.92±3.55△△*747.57±5.54△△**##729.36±7.18△△**TNF-α 53.98±6.19 96.55±4.35△△87.34±2.77△△*81.46±6.24△△*74.67±8.20△△**##66.38±7.43△△**IL-1β 36.54±3.82 66.57±4.63△△64.22±3.76△△56.81±6.28△△*#52.17±2.19△△**##42.33±5.46△**IL-6 347.92±7.13 463.31±4.33△△421.37±7.18△△*403.61±3.27△△*378.71±6.06△**##360.07±4.81△**TNF-α 27.34±7.68 63.28±6.34△△56.63±3.59△△*53.78±4.36△△*47.17±6.22△△**##42.62±4.10△△**

2.3 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清中LDH、SOD、GSH活性及MDA、NO含量的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血清中SOD、GSH含量降低，LDH、MDA、NO含量升高，差异具有统计学意义（P均＜0.01）。与模型组比较，TAEP各剂量组及地塞米松组干预能够升高大鼠血清SOD、GSH含量，降低LDH、MDA、NO含量（P均＜0.05或0.01）；TAEP 125、250、500 mg/kg组SOD、GSH含量随着受试物浓度升高而上升，LDH、MDA、NO含量随着受试物浓度升高而下降，500 mg/kg组与125 mg/kg组比较，各指标差异显著（P均＜0.05）；TAEP 500 mg/kg组抗氧化效果与地塞米松组比较接近，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表4。

表4 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清中LDH、SOD、GSH活性及MDA、NO含量的影响（n=10，

表4 TAEP对PM2.5致ALI大鼠血清中LDH、SOD、GSH活性及MDA、NO含量的影响（n=10，

与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与125 mg/kg TAEP组比较，#P＜0.05.

NO浓度/（μmol/L）43.17±6.34 102.34±3.66△△87.72±5.35△△*82.12±4.53△△*76.24±1.37△△*#52.18±1.59△**分组正常对照组模型组TAEP组剂量/（mg/kg）--地塞米松组125 250 500 2 LDH浓度/（U/L）207.13±7.27 343.11±4.88△△317.81±6.35△△*283.94±6.25△△*228.39±7.46△**#176.78±3.86△**SOD浓度/（U/mL）111.35±2.23 89.59±4.43△125.71±1.85△*130.52±2.48△*133.87±3.64△*#154.22±6.31△**GSH浓度/（μmol/L）3.37±1.14 1.39±0.48△△4.21±1.33△**5.01±1.67△△**5.84±0.32△△**#10.66±3.37△△**MDA浓度/（nmol/mL）37.69±7.42 115.82±3.74△△89.07±4.33△△*82.36±4.04△△*76.15±3.87△△*#57.18±2.31△△**

2.4 TAEP对PM2.5致ALI大鼠肺组织W/D的影响

与正常对照比较，模型组大鼠W/D升高，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；与模型组比较，TAEP各剂量组及地塞米松组干预能够降低ALI大鼠肺W/D（P均＜0.05）；TAEP 125、250、500 mg/kg组W/D随TAEP剂量升高呈降低趋势，125 mg/kg组与500 mg/kg组间差异显著（P＜0.05）；TAEP 500 mg/kg 组W/D与地塞米松组接近（P均＞0.05），见表5。

2.5 病理组织学观察

正常对照组动物肺脏肺泡排列整齐，结构完整，无明显水肿和炎细胞浸润，支气管及细支气管均结构完整（图1A）；与正常对照组相比，模型组动物肺脏可见肺泡间隔增宽，肺脏炎细胞浸润及新鲜出血（图1B）。与模型组相比，TAEP 125 mg/kg组动物肺脏可见肺泡间隔增宽，支气管周围炎细胞浸润（图1C）；TAEP 250 mg/kg组动物肺脏可见炎细胞浸润，肺泡及各级支气管均结构完整（图1D）；TAEP 500 mg/kg组动物肺脏可见少量炎细胞浸润，肺泡及各级支气管均结构完整（图1E）；地塞米松阳性对照组动物肺脏肺泡及各级支气管均结构完整，无明显水肿及炎细胞浸润（图1F）。综上所述，各组之间比较结果显示，TAEP 500 mg/kg组与地塞米松组动物肺脏组织病理学观察结果更为相近。

2.6 TAEP对PM2.5致ALI大鼠肺组织病理分级的非参数检验

见表5。非参数检验结果显示总体差异有统计学意义（P均＜0.01），TAEP对PM2.5致ALI大鼠肺组织病理分级各组间分布不同。与对照组比较，模型组秩均值显著升高（P均＜0.01）；与模型组比较，TAEP各剂量组秩均值均明显下降，差异均有统计学意义（P均＜0.05或P均＜0.01）；TAEP 125、250、500 mg/kg组秩均值逐渐下降，与125 mg/kg组比较，250和500 mg/kg组秩均值显著降低，差异具有统计学意义（P均＜0.05），TAEP各剂量组与地塞米松组比较差异具有统计学意义（P均＜0.05）。

图1 大鼠急性肺损伤病理组织学观察（HE，×40）

表5 TAEP对PM2.5致ALI大鼠肺组织病理分级的非参数检验和对肺组织W/D的影响（n=8）

3 讨论

近些年，空气污染已成为影响人类健康的重要因素之一，PM2.5由于粒径小，比表面积大等特性，易于进入血液循环，造成呼吸系统及心血管系统疾病[12]，目前认为PM2.5对呼吸系统损伤的主要机制为以下几方面[13]：自由基过氧化损伤；细胞钙稳态失调；巨噬细胞的损伤。由于PM2.5的来源受工业粉尘、化学燃料燃烧、风沙扬尘等影响，不同地区PM2.5组分差异性较大，因而采用公认的PM2.5采集方法十分必要[14]。本研究中的采样仪器是用于环境检测部门采集大气中总悬浮颗粒物及PM样品的必备仪器，符合WHO及美国国家EPA标准，符合我国环保局及企业标准的相关条例[15]。仪器中加装了QG-1000型PM切割器，通过捕获膜筛选出符合标准的PM2.5颗粒，采样时间则固定在冬季供暖期。由于本研究建立的是大鼠ALI模型，通过前期急性毒性实验，我们发现采用大鼠气管滴注技术将PM2.5粉末配置成14 mg/kg剂量的混悬液造模效果最佳。

ALI是由各种内外致病因素所导致的急性、进行性的肺部炎症反应综合征，可造成肺泡上皮及毛细血管内皮细胞损伤，伴弥漫性肺间质及肺泡水肿，其发展至严重阶段为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）[16]。目前对 ALI/ARDS尚无特效疗法，大多研究集中于药物治疗和机械通气[17]。我国拥有丰富的民族中药资源，阿尔泰金莲花作为新疆民族特色药材，具有抗炎、镇痛、抗病毒等作用，研究其对PM2.5致ALI预防保护作用，具有十分重要的研究价值及现实意义。糖皮质激素具有较强的抗炎作用，临床普遍应用治疗ALI/ARDS，其中地塞米松使用最广泛，疗效显著，其药理作用[18]为：抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放来达到抗炎效果，因此，本研究以地塞米松作为阳性对照组用药，以便更好的反映TAEP对ALI的预防保护作用[19]。

PM2.5致ALI发生的实质是失控的炎症反映，WBC、LYM及NEUT计数升高是炎症反应最重要的特征[17]。本研究中，模型组大鼠WBC、LYM、NEUT计数明显高于正常对照组，说明PM2.5暴露可刺激机体产生炎症因子，发生炎症反应；随着TAEP剂量的增加，125、250、500 mg/kg组WBC、LYM、NEUT计数呈现降低的趋势，且均低于模型组，说明TAEP能够有效降低炎症因子的损害，从而缓解细胞损伤。病理结果显示：低、中、高TAEP剂量组随TAEP剂量增加肺泡形态结构破坏降低，水肿及炎症细胞浸润减少，也可说明TAEP对ALI发生的炎症反应具有防治效果。

IL-1β、IL-6、TNF-α是公认的促炎细胞因子[20]。TNF-α是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，它能够激活NF-κB传导通路，促使IL-1β、IL-6等多种炎性介质释放[21]，其中IL-1β可通过诱导前列腺素和组胺的合成造成炎症损伤[22]，而IL-6能够活化B细胞，加重炎症反应发生及趋化因子表达[23-24]，进而形成级联放大反应，进一步造成组织细胞损伤。本研究中，模型组血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均高于正常对照组，提示PM2.5进入大鼠呼吸道后，会产生炎症刺激作用，促使机体释放炎症介质和趋化因子，从而对大鼠肺部造成损伤；TAEP各剂量组血清和BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于模型组，随TAEP剂量增高，呈现降低趋势，且肺部病理结果显示肺脏结构明显改善，提示TAEP可通过免疫调节作用，降低PM2.5造模大鼠体内IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，进而起到对肺部组织细胞的保护作用。本研究中，血清组IL-1β、IL-6、TNF-α水平要高于BALF组，这可能与ALI发生急性炎症反应及自身免疫反应相关，具体有待更进一步研究，血清中各指标可反映ALI病情严重程度，而BALF各指标可作为早期诊断ALI的方式。

正常情况下，机体氧化/抗氧化系统处于平衡状态，给大鼠滴注PM2.5混悬液后，由于PM2.5成分中包含大量重金属元素[25]，可使机体产生过量自由基，当机体清除自由基能力无法代偿时，会产生氧化性损伤，由此肺泡上皮及血管内皮细胞会产生MDA、LDH及NO，同时抗氧化系统发挥清除作用，会产生大量抗氧化酶SOD、GSH等，当机体无法清除过多活性氧时，会发生氧化应激状态，从而进一步造成机体损伤[26-27]。已有研究[28-29]发现TAEP能够抑制超氧阴离子、羟自由基及二苯代苦味酸酰基肼（DPPH）自由基，从而起到抗氧化作用。本研究中，与模型组比较，TAEP各剂量组SOD、GSH水平上升，MDA、LDH、NO水平下降，说明TAEP可减轻PM2.5对机体造成的氧化应激损伤，提示可能与TAEP自由基清除能力提升，降低脂质过氧化有关；另一方面，也意味着寻找降低ALI氧化应激损伤的方法是治疗和预防ALI的一个重要潜在方向。

W/D是反映组织水肿程度的指标，比值越高说明水肿程度越严重。有研究[30]认为，肺间质及肺泡水肿及炎症渗出增多是湿重增加的主要原因，这与本实验病理结果显示相同。本研究中，TAEP 125、250、500 mg/kg组W/D值均低于模型组，说明TAEP可有效缓解ALI时的肺水肿。

TAEP具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用，但对其具体作用机制尚不明确[31-32]。方明月等[33]发现TAEP通过影响TLR3、4、7等信号通路来发挥抗炎、抗病毒的作用，且同时涉及到多成分、多靶点、多通路协同作用；杨国栋等[34]发现TAEP对人乳腺癌MCF-7细胞具有抑制作用，可能与NF-κB及caspase-9通路有关。

综上，TAEP对于PM2.5诱导的大鼠急性肺损伤有一定的保护作用，通过自身免疫调节，提升自由基清除能力，以及缓解组织细胞的水肿来降低PM2.5对机体的损伤，但具体影响机制还有待更进一步研究。