小鼠肝损伤模型研究初探

张璐 魏韬 周晶琳 王祥美 白清杰 刘广旭 杨静波 祝慧慧

肝脏是最重要的解毒器官，承担着人体重要物质的合成和代谢，并参与能量生成和转换[1]。肝损伤是人类常见的疾病，严重影响人类的健康。临床上，肝切除术后的顺利恢复主要取决于残余肝的迅速再生能力以及肝功能的迅速恢复能力[2]，同时肝癌合并肝硬化的比率较高，在50%～85%之间，严重影响肝脏的再生能力和储备功能[3]。肝切除术与门静脉结扎术结合应用，是一种简单、安全、有效的方法[4]。肝切除小鼠模型是研究人类肝切除术的有效路径，可以为研究肝脏代谢、急性肝损伤、肝肿瘤、肝脏再生以及肝脏移植等方面提供技术平台。

1 仪器和药品

生物安全柜（博科11231BBC86）、狗兔二用解剖台（汉博BXT-2），手术灯、电子秤、鼠笼、小鼠固定用泡沫砖、大头针、固定线、注射器、针头、手术刀、手术剪、手术镊、眼科剪、蚊式止血钳、眼科镊、培养皿、缝针、非吸收性外科缝线、无菌纱布、无菌棉球、一次性使用灭菌橡胶外科手套。生理盐水（科伦）、医用酒精（利尔康）、碘伏（安捷）、乌拉坦（阿拉丁）[5]。

2 实验动物

本实验中使用的小鼠均来源于牡丹江医学院实验动物中心。小鼠雌雄随机，体质量为20～25 g。饲养于SPF级环境中，温度控制在（22.0±2.0）℃，饲喂普通饲料，自由进食、进水。

3 实验方法

3.1 小鼠的捉拿、麻醉和固定

事先用注射器抽取已配置好的麻醉药物20%乌拉坦按0.5 mL/100 mg剂量备用。随机选取禁食过夜12小时的小鼠，左手持手术镊夹住小鼠尾部将其从鼠笼中取出，捉拿时用右手提起小鼠尾后部，旋转至晕，随后将其置于电子秤上的烧杯中称重，读取数值。麻醉时用右手提起小鼠尾部将其置于鼠笼盖或其他粗糙表面上，以使其后肢悬空，仅允许其前肢着地，在小鼠向前爬行的同时，左手握拳，用拇指和食指抓紧小鼠双耳和头颈部的被毛。然后翻转手腕部使手背向下，此时小鼠仰卧位固定于左手中，并确保小鼠头部向下倾斜。本实验采用腹腔注射，穿刺部位选择在下腹部左侧，该部位无重要器官。麻醉前使小鼠腹部向上，将注射器针头与其腹中线成45°，在选定的部位刺入腹腔，刺入时需与腹部皮肤呈20°。刺入腹腔时，术者会感觉阻力突然减小，此时应抽回针栓，确定针头未刺入小肠、膀胱或血管后，再缓慢注入药物。固定前先用医用胶带将小鼠固定用泡沫砖固定于狗兔二用解剖台上，然后将四只大头钉分别固定于泡沫砖的两个侧面，作为小鼠的手术台。将麻醉好的小鼠仰卧位固定于泡沫砖上，四肢用固定线分别系于泡沫砖侧面的4只大头钉上。头部用固定线系住小鼠门齿固定于泡沫砖顶端大头钉上[6-7]。

3.2 手术操作

手术器械手术前均需高压灭菌。先用手术剪剪去小鼠腹部被毛，采用医用酒精对其腹部皮肤进行消毒，其上铺纱布。助手双手持止血钳夹持腹部正中线两侧的皮肤并尽量向上提起，防止伤及脏器，术者用手术剪自剑突下剪开被毛3 cm左右，然后同样用手术剪自剑突下剪开腹部皮肤和肌肉组织3 cm左右，使用蚊式止血钳牵拉腹腔切口两侧，暴露小鼠腹腔后可见肝脏。小鼠肝脏可分为四个解剖功能单位，包括中叶、左外叶、右叶和尾叶。其中，中叶又可分为左中叶和右中叶，左中叶覆盖于左外叶之上；右叶又可分为右上叶和右下叶，右上叶被覆于右中叶之下，右下叶与右肾相邻；尾叶根据与下腔静脉的关系又可分为前尾叶和后尾叶，尾状突贴合下腔静脉，一般很少出现。辨别清晰结构后，方可游离肝脏周围的韧带和肝脏各叶。切除肝左外叶：使用手术剪剪开镰状韧带至下腔静脉前方，将左外叶韧带和部分左侧冠状韧带抬起，游离肝左外叶。取1号手术线置于肝脏脏面，剪开肝胃韧带并绕过左外叶，在肝脏膈面靠近根部位置结扎后剪下左外叶。切除肝左中叶和右中叶：抬起肝左中叶和右中叶，1号线从脏面绕过，靠近膈面根部位置结扎后剪下这两叶。肝部结扎切除完成，检查无出血后，以0号手术线迅速缝合腹部切口，并注射抗生素，术后小鼠苏醒后确保其能正常进食、进水，定时观察小鼠生存情况[8-9]。

4 总结

部分肝切除是造成肝脏机械性损伤的一种方法，使用小鼠作为研究对象比较经济。结扎切除肝脏左外叶、左中叶和右中叶，切除量约占总肝量的68%，术后7天内小鼠均存活。本研究初步探讨并成功建立70%肝切除小鼠模型的方法。以此研究为基础，优化实验方法，提高操作技能，减少或消除各种术中及术后并发症如出血、 胆漏、 腔静脉狭窄等情况的发生概率，提高小鼠存活率，探索建立稳定的且成功率较高的肝切除小鼠模型[10-12]。结合术后小鼠肝损伤程度及生存状况，使用70%肝切除模型用于后续实验研究。本研究虽然成功建立了小鼠肝损伤模型，但由于肝损伤的可逆性，与临床上由于病毒和有毒物质引起的急性肝损伤有所不同，因此今后可以此次研究数据为基础，增加肝脏应激如使用CCL4、酒精等物质制备肝损伤小鼠模型，进而研究和筛选保肝药物，探索保肝作用机理。