孕晚期妇女无乳链球菌携带监测及其与阴道微环境关系研究

唐群力，肖林林，魏取好，肖 虎，赵卫卫，冯 景

(上海交通大学附属第六人民医院南院检验科，上海 201499)

无乳链球菌(或称B族链球菌)是一种可以在胃肠道和泌尿生殖道中定植的条件致病菌，常定植于人类直肠和生殖道中，属β溶血的革兰阳性链球菌。无乳链球菌通常和怀孕期间与产后期间的医疗间期相关易感因素关系密切，当机体免疫力低下、广泛使用抗菌药物等时，容易引起机会性感染[1-2]。无乳链球菌与新生儿的致命疾病如败血症、肺炎和脑膜炎有关,被认为是新生儿疾病发展的最重要风险之一，无乳链球菌在孕妇中的定植率根据社会经济、文化和人口状况及用于检测的方法而有所不同[3]。本研究采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测孕晚期妇女无乳链球菌带菌状况,采用半定量法检测其阴道分泌物乳酸杆菌水平，并结合数据分析相互之间的影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2017年1月至2018年1月在本院妇产科门诊和住院病房就诊的孕晚期妇女(34～37周)共5 855例作为研究对象，并选取100例健康体检女性为对照组，每位研究对象由妇产科医生同时采集阴道分泌物(一支拭子样本)及直肠分泌物(一支拭子样本)送检，无乳链球菌携带组、阴性组、对照组的乳酸杆菌检测样本使用白带常规涂片后进行瑞姬染色。阴性质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，阳性质控菌株为无乳链球菌ATCC13813。采集过程严格按照样本采集手册执行，取样对象知情同意。

1.2仪器与试剂 RT-qPCR仪购自瑞士罗氏诊断推出的Roche lightcycle 480Ⅱ，无乳链球菌核酸检测试剂盒(荧光PCR法)购自泰普生物科学(中国)有限公司，瑞氏-姬母萨染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。试剂盒采用PCR及荧光标记探针，检测临床样本中无乳链球菌特定基因(CAMP)，从而判断无乳链球菌的存在。据文献报道，对于无乳链球菌的临床样本检测中，RT-qPCR法与细菌培养法、测序法(金标准)的符合率达95%以上[4]。

1.3方法

1.3.1无乳链球菌检测 在样本拭子管内加入1 mL清洗液(10×浓缩清洗液与灭菌纯化水按1∶9进行稀释)，用震荡混匀器高速震荡2 min，将其制成样本混悬液。吸取全部样本混悬液至1.5 mL离心管内，13 000 r/min离心5 min后弃去上清，加入1 mL清洗液震荡混匀重悬，13 000 r/min离心5 min后弃去上清(视样本浑浊情况可重复本步骤)，加入50 μL清洗液重悬。然后向每只样本管中加入1管等量提取固形物，用震荡混匀器高速震荡5 min，连同阴性对照、阳性对照质控样本同样提取流程提取基因组模板后，瞬时离心，每管分别加入10 μL内参照，95 ℃干浴2 min，冰浴5 min后13 000 r/min离心1 min，各取5 μL上清作为模板加入至配好的PCR扩增体系中进行扩增。扩增程序：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 45 s，共40个循环。扩增完毕，调整基线和阈值，确认阴阳性对照及质控在有效范围内后判读结果，阴性样本FAM Cp值=40或“Undet”，阳性样本FAM Cp值≤33且曲线呈明显对数增长。

1.3.2阴道微环境指标检测[5]将送检的阴道分泌物制作出分泌物涂片，高倍镜下观察判读清洁度并记录结果，待干燥后用瑞氏-姬母萨染色液染色、晾干，于显微镜下油镜下观察乳酸杆菌水平及阴道菌落多样性。依据2010年廖秦平[6]提出的阴道微生态评价标准，阴道乳酸杆菌菌群密集度及阴道菌群多样性均可分为4个等级。其中，阴道乳酸杆菌菌群密集度的4级分级情况为：Ⅰ级(+)，油镜下观察每个视野平均细菌数量为1～9，换算成具体数值为105～106/mL；Ⅱ级(++)：油镜下观察每个视野平均细菌数量为10～99，换算成具体数值为107～108/mL；Ⅲ级(+++)：油镜下观察每个视野平均细菌数量超过100，换算成具体数值为109～1010/mL；Ⅳ级(++++)：油镜下观察每个视野细菌聚集成团，或密集黏膜上皮细胞，换算成具体数值为1010/mL以上。阴道菌群多样性4级分级情况为：Ⅰ级(+)，油镜下观察每个视野平均能辨别1～3种细菌；Ⅱ级(++)，油镜下观察每个视野平均能辨别4～6种细菌；Ⅲ级(+++)，油镜下观察每个视野平均能辨别7～10种细菌；Ⅳ级(++++)，油镜下观察每个视野平均能辨别11种及以上细菌。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据分析。计数资料以率表示，不同分组间采用两组样本率的χ2检验。以Ρ<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1孕晚期妇女无乳链球菌携带情况 5 855例门诊和住院病房就诊的孕晚期妇女(孕34～37周)中共检出无乳链球菌携带者563例(563/5885,9.6%)，其中阴道分泌物检出143例(143/5 885,2.4%)，直肠分泌物检出426例(426/5 885,7.2%)，二者同时检出阳性有106例(106/5 885,1.8%)，占总阳性人群的18.8%。对照组中检出阳性4例，阳性率为4.0%。

2.23组研究对象阴道清洁度、乳酸杆菌水平及阴道菌群多样性情况 无乳链球菌阳性组乳酸杆菌(Ⅱ～Ⅲ级)、菌群多样性(Ⅱ～Ⅲ级)、清洁度(Ⅰ度)、微环境失调的概率见表1。其中无乳链球菌阳性组、阴性组各指标与对照组相比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性组各指标与对照组相比，差异亦均有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组研究对象阴道微环境相关指标的比较[n(%)]

注：与对照组比较，*P<0.05；与阴性组比较，#P<0.05

3 讨 论

目前研究报道普遍认为，无乳链球菌是孕晚期妇女发生严重感染性疾病的主要致病菌之一，可以造成孕妇及婴儿不良后果[7-8]。女性阴道通常被认为是一个复杂的微生态体系，乳酸杆菌含量、菌群多样性、清洁度等因素对维持微环境的平衡和预防感染的发生起到了非常重要的作用[7,9-10]。因此，对孕晚期妇女进行无乳链球菌筛查，同时调查阴道微环境相关指标，结合分析后可采取积极有效的预防和治疗措施，降低孕晚期妇女感染率。

微生物细菌培养鉴定是鉴别及诊断无乳链球菌感染的“金标准”，但其周期长、操作繁琐、检出率低等明显的缺点不能很好地满足临床准确、快速鉴定的诉求，同时烦琐的操作一定程度了造成了检验人力资源的浪费。RT-qPCR法检测无乳链球菌具有快速、操作简便、灵敏度高等特点，可以较好地解决以上问题，目前广泛应用于无乳链球菌的检测[10]。阴道微环境有一套较为完善的临床评价体系，当阴道菌群密度为Ⅱ～Ⅲ级、多样性为Ⅱ～Ⅲ级、清洁度为Ⅰ度、乳酸杆菌正常、阴道酸碱度为小于4.5时，定义为阴道微环境正常。当任何一项异常，均可诊断为微环境失调[11]。

本研究对孕晚期妇女采用RT-qPCR法检测无乳链球菌携带情况，并检测记录微环境相关的各项指标结果。结果显示，本院孕晚期妇女无乳链球菌携带率为9.6%，与国内报道的汉中[12]、北京[13]、重庆[14]地区的携带率持平，低于韩国的13.0%[10]，处于欧洲国家6.5%～36.0%和美国2.0%～29.0%[15]范围的中下游水平。本研究显示，孕晚期无乳链球菌阳性组阴道微环境失调率高于阴性组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，该结果进一步证实了育龄妇女无乳链球菌感染高发可能与生殖道微环境改变有关的猜测。

4 结 论

本院孕晚期妇女的无乳链球菌携带率处于已有文献报道的正常范围内，无乳链球菌感染的孕晚期妇女阴道微环境表现为失调，阴道微生态平衡遭到破坏，增加了罹患生殖道感染的风险，在临床上应该引起足够的重视，应该加强无乳链球菌的检测和监控，以便采取预防措施，提高孕期生活质量，避免带来严重后果。同时，无乳链球菌检测的影响因素众多，样本异质性问题尤甚，分析前其过程应该加强监控。