槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

叶发银，吕 霞，李金凤，王勇德，赵国华,3,

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市中药研究院，重庆 400065；3.重庆市甘薯工程技术研究中心，重庆 400715）

作为食品配料，淀粉在食品中用途广泛。随着食品工业对食品配料性能要求的不断提高，原淀粉的有些性质已不能满足要求。通常采用物理法、化学法或酶法改造原淀粉得到变性淀粉，以满足食品加工所需功能性质[1]。其中，化学改性是增加或提高淀粉功能性质的有效方法，全球约80%的变性淀粉采用化学法生产[2]。相比原淀粉，变性淀粉具有更优良的性质，如黏度低且稳定、凝沉性弱、成膜性好、溶解性或透明度更高[3]。有些变性淀粉可用作营养物或食品功能因子靶向输送载体，在功能食品领域具有巨大的应用潜力[4-5]。通过化学改性调控淀粉消化特性的研究也非常活跃。Han等[6]发现蜡质玉米淀粉经交联-羟丙基化处理可获得慢消化淀粉含量高（21%）的产品，经交联-乙酰化处理可获得抗消化淀粉含量高（24%）的产品，经辛烯基琥珀酸酐处理则可以同时提高产品中慢消化淀粉和抗消化淀粉含量。He Jinhua等[7]认为辛烯基琥珀酸酐改性最适合用来制备慢消化淀粉（28.3%），原因在于辛烯基琥珀酸基团对淀粉酶有非竞争性抑制作用，影响淀粉酶对淀粉催化水解。Carlos-Amaya等[8]研究了化学改性香蕉淀粉对其消化性的影响，结果表明，单独酯化或交联处理可显著增加慢消化淀粉含量，采用酯化-交联处理则可以显著增加抗消化淀粉含量。Shah等[9]研究发现燕麦淀粉经乙酰化改性后，其抗消化淀粉的含量可提高2 倍。

近年来，具有生物活性的变性淀粉开发引起了国内外学者的兴趣。研究发现，淀粉硫酸酯[10]和双醛淀粉[11]具有较好的自由基清除能力。Mathew[12]和Wen Yu[13]等分别将阿魏酸共价结合到马铃薯淀粉及玉米淀粉上，均得到具有抗氧化活性的产物。Tan Wenqiang等[14]通过多步反应得到具有良好抑菌活性的三氮唑淀粉衍生物。

槲皮素是果蔬食品原料中常见的黄酮类物质，具有多种有益的生理及药理活性[15]。研究发现，将槲皮素共价结合到一些高分子材料上，一方面可作为载体实现向机体靶标递送槲皮素并提升其生物利用度，另一方面可赋予该材料新的性能[16-17]。因此，从理论上所得产物槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯可以在改善淀粉理化特性的同时改善或赋予其抗消化、抗氧化等生物活性。通过双改性或复合改性可赋予变性淀粉多种功能性质。本研究以甘薯淀粉为原料，在制备得到高取代度羧甲基淀粉的基础上，通过酯化反应实现其与槲皮素的共价结合，重点探讨合成条件（底物配比、活化试剂用量、反应体系pH值）对槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯淀粉（食品级；水分质量分数11.2%，灰分质量分数0.41%，蛋白质量分数0.32%，脂质质量分数0.37%）四川友嘉食品有限公司；槲皮素（二水）（分析纯）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC·HCl）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）（均为分析纯） 上海阿达玛斯试剂有限公司；异丙醇、浓盐酸、一氯乙酸、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HWS-26型数显恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器有限公司；85-2A型数显恒温磁力搅拌器 金坛市科析仪器有限公司；pHS-25CW型pH计 上海般特仪器制造有限公司；SHB-III型循环水式多用真空泵、RE-5298型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LC-20A型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（二极管阵列检测器） 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的制备

高取代度羧甲基甘薯淀粉的制备参照具本植等[18]的方法进行。采用滴定法[19]测得羧甲基甘薯淀粉的羧甲基化度为0.659。称取一定量羧甲基甘薯淀粉、活化试剂EDC·HCl及催化试剂DMAP分别于体积分数50% DMSO溶液中溶解，配制成一定浓度的槲皮素（二水）DMSO溶液。首先将羧甲基甘薯淀粉溶液、EDC·HCl溶液与槲皮素溶液按一定比例混合，接着加入DMAP溶液，维持体系pH值在一定范围，35 ℃磁力搅拌避光反应16 h。反应结束后加入4 倍体积的无水乙醇静置30 min醇沉，收集沉淀用甲醇反复淋洗，加入30 mL 50% DMSO溶液将产物再次溶解，经醇沉、淋洗3 次后置于40 ℃真空干燥箱干燥48 h，即得黄色粉末状槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。

图1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成路线图Fig.1 Synthesis scheme of quercetin-carboxymethyl sweet potato starch ester

以甘薯淀粉作为原料，经一次羧甲基化制备得到羧甲基化度为0.659的羧甲基甘薯淀粉，槲皮素与羧甲基甘薯淀粉通过EDC·HCl和DMAP介导的酯化反应生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯（图1）。活化试剂EDC·HCl广泛用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成[20-21]，在酯化过程中与羧甲基甘薯淀粉反应生成中间体O-酰基异脲，随后在催化剂DMAP的作用下，O-酰基异脲与槲皮素羟基发生亲核反应生成槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯[22]。

1.3.2 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的测定

样品前处理：称取0.1 g槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，磁力搅拌6 h使槲皮素水解释放。用6 mol/L盐酸溶液调节pH 0.5，在分液漏斗中用90 mL乙酸乙酯分3 次萃取，合并有机层，60 ℃旋蒸至干，用甲醇溶解并定容，过0.45 μm滤膜后用HPLC测定释放的槲皮素含量。

H P L C条件：色谱柱：T h e r m o B D S C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：A相为2%磷酸溶液，B相为色谱级甲醇；检测条件：A相-B相体积比15∶85，流速0.8 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃，检测波长293 nm。

标准曲线制作：用DMSO配制质量浓度为1 g/mL槲皮素（二水）储备液，稀释至1、2.5、5、7.5、10、15、20 mg/mL，取不同质量浓度溶液1 mL于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，按照上述方法对样品处理（水解、萃取、旋蒸、定容、过滤膜）后进行HPLC分析。以标准槲皮素（二水）的质量（mg）为横坐标（x），其峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到回归方程y=670 800x－562 210，R2=0.995 1。

取代度的计算：按照上述HPLC条件测定样品经前处理后释放槲皮素的峰面积，经回归方程计算得到槲皮素（二水）含量并转换为物质的量，取代度按照下式计算：

式中：162为脱氧葡萄糖单元的相对分子质量；18为水分子的相对分子质量；338为槲皮素（二水）的相对分子质量；n为槲皮素（二水）的物质的量/mol。

1.3.3 单因素试验

预实验结果表明，反应温度和反应时间对产物槲皮素取代度的影响不显著，因此选择对取代度有显著性影响的参数（底物配比、活化剂与淀粉配比和反应体系pH值）作进一步考察。

固定羧甲基甘薯淀粉质量浓度51 g/L、反应温度35 ℃、EDC与脱水葡萄糖基（anhydroglucose unit，AGU）物质的量比（NEDC/AGU）1.2∶1、反应体系pH 7.4，考察底物配比（槲皮素（二水）与羧甲基甘薯淀粉中AGU的物质的量比，N槲皮素/AGU）0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1对酯化反应取代度的影响；固定反应温度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、反应pH 7.4，考察NEDC/AGU为0.6∶1、1.2∶1、1.8∶1、2.4∶1、3.0∶1时对酯化反应取代度的影响；固定反应温度35 ℃、N槲皮素/AGU1.0∶1、NEDC/AGU1.2∶1，考察反应体系pH值为5.0、5.8、6.6、7.4、8.2、9.0时对酯化反应取代度的影响。

1.3.4 响应面试验

结合单因素试验结果，根据Box-Behnken设计原理，设计3因素3水平响应面试验。考察影响酯化反应槲皮素取代度的3 个因素：N槲皮素/AGU（X1）、NEDC/AGU（X2）及反应体系pH值（X3）对产物槲皮素取代度的影响，因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table1 Codes and levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 数据分析与处理

用SPSS 19.0和Design-Expert 8.0进行数据分析。每个样品测定3 次，数据以表示。方差分析用Tukey’s HSD进行分析（P＜0.05，显著差异）。

2 结果与分析

2.1 槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的合成

槲皮素在羧甲基甘薯淀粉上的共价结合可通过HPLC测定碱水解释放出的槲皮素得到证实。此外，反应过程中体系溶解性的变化也反映了酯化反应的进行。原本澄清的均相体系随反应进行逐渐浑浊并发生分层，表明相对于羧甲基甘薯淀粉，槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的水溶性下降。研究指出，淀粉与松香酸发生酯化反应后的产物[23]以及烷基取代淀粉[24]水溶性较差，原因在于这些产物中出现了大量疏水性基团。如图2所示，得到的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯为淡黄色粉末，其颜色随取代度提高逐渐加深。

图2 不同取代度槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯与羧甲基甘薯淀粉的颜色变化Fig.2 Color profiles of quercetin-carboxymethyl sweet-potato starch esters with different DS values

2.2 底物配比N槲皮素/AGU对酯化反应的影响

由图3可知，当N槲皮素/AGU为0.5∶1时，产物的取代度较低。在N槲皮素/AGU≤2.0∶1时，产物的取代度随槲皮素浓度的增大而显著提高（P＜0.05），但之后再增加槲皮素浓度对取代度的影响不显著（P＞0.05）。这可能是由于槲皮素起初浓度的增加使得槲皮素分子与中间体O-酰基异脲碰撞的概率增大，从而提高槲皮素偶联的概率，但槲皮素浓度增加到一定程度后，中间体被槲皮素分子所饱和，槲皮素浓度不再是偶联反应的限制性因素，取代度不再增加[25]。在后续响应面试验设计中，底物配比选择N槲皮素/AGU1.0∶1～2.0∶1进行考察。

图3 底物配比（N槲皮素/AGU）对酯化反应的影响Fig.3 Effect of Nquercetin/AGU on DS

2.3 活化剂与淀粉配比（NEDC/AGU）对酯化反应的影响

活化剂EDC·HCl具有碳二亚胺（—N=C=N—）官能团，主要用来活化羧基，促进酰胺化反应或酯化反应[26-27]。由图4可知，槲皮素取代度随NEDC/AGU的增加呈先增大后减小的趋势，NEDC/AGU从0.6∶1增加到1.2∶1，产物取代度提升1.3 倍；NEDC/AGU增加到1.8∶1时取代度的提升不明显；NEDC/AGU继续增加则导致产物取代度下降。这说明适当增加EDC·HCl浓度对酯化反应是有益的，过量的EDC·HCl使副反应加剧导致产品取代度下降[25]。在后续响应面设计试验中，活化剂与淀粉配比选择NEDC/AGU0.6∶1～1.8∶1进行考察。

图4 活化剂与淀粉配比（NEDC/AGU）对酯化反应的影响Fig.4 Effect of NEDC/AGU on DS

2.4 反应体系pH值对酯化反应的影响

图5 反应体系pH值对酯化反应的影响Fig.5 Effect of initial reaction pH on DS

从图5可以看出，反应体系pH值对槲皮素取代度具有显著影响（P＜0.05）。在pH 5～9范围内，随pH值升高，取代度呈现先升高后下降的趋势，并在pH 7.4时取代度达到最大值。原因在于，槲皮素的解离常数为pK17.03和pK29.15[28]，偏碱性环境有利于酚羟基的解离，因此槲皮素在弱碱性条件下容易偶联到中间体O-酰基异脲上，但槲皮素在碱性环境中变得不稳定易降解，且碱性过强会引起淀粉的脱氧葡萄糖单元上的羟基解离，此后pH值的升高反而使取代度下降。鉴于槲皮素在酸性或碱性情况下均容易降解，在后续响应面设计试验中，pH值范围选择5.8～7.4进行考察。

2.5 响应面试验结果与分析

表2 取代度的Box-Behnken 试验方案与结果Table2 Box-Behnken design with experimental and predicted DS values

对表2数据进行多元回归拟合，得到槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的多元二次回归方程为取代度=0.475+0.778X1+0.048 4X2－0.193X3+0.014 7X1X2－0.008 44X1X3+0.001 04X2X3－0.009 63－0.007 03+0.017 4。

从表3可以看出，模型P值为0.005 3（P＜0.01）极显著相关，失拟项P值为0.061 4（P＞0.05）不显著，模型总相关系数R2值为0.915，说明模型选择合适，拟合度良好。用该模型预测分析不同反应条件下制得的槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的取代度，能较好地描述合成工艺中产物取代度随参数条件的变化规律。从表3还可以看出，二次项和交互项对槲皮素-羧甲基甘薯淀粉的取代度影响不显著（P＞0.05），单因素X2和X3对取代度的影响极显著（P＜0.01）。在所选因素范围内，各因素对槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影响排序为活化剂与淀粉配比（NEDC/AGU）＞反应体系pH值＞底物配比（N槲皮素/AGU）。

表3 取代度的二次响应模型方差分析Table3 Analysis of variance (ANOVA) for the response surface quadratic model describing the effect of variables on DS

2.6 响应面分析及模型验证实验结果

图6 底物配比、活化剂与淀粉配比和反应体系pH值对槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface plot and contour plots showing the interactive effects of variables on DS

从图6A和6C可知，分别固定N槲皮素/AGU和反应体系pH值时，产物取代度都随NEDC/AGU的增大而增大，呈现线性关系，且从图6A能看出，当N槲皮素/AGU相对较高时，EDC对取代度的影响更为显著；从图6A和6B可知，N槲皮素/AGU的变化对产物取代度的影响并不显著，这在方差分析（表3）中也有体现，只有当pH值较低或EDC浓度较高时，N槲皮素/AGU才对反应产物的槲皮素取代度有一定影响，且这种影响是正相关的；从图6B和6C得到，分别固定N槲皮素/AGU和NEDC/AGU时，pH值对槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯取代度的影响较为显著，pH值上升，产物取代度增加，这与单因素试验的趋势相同。

按照Design-Expert 8.0软件给定的最优工艺参数底物配比（N槲皮素/AGU，X1）2∶1、活化剂与淀粉配比（NEDC/AGU，X2）1.8∶1、反应体系pH（X3）7.4时，进行3 次验证实验，实测产物的取代度为0.114 9±0.007 5，与预测值（0.122 5）相比较差异不显著（P＞0.05），证明该回归方程的可靠性（相对误差6.14%）。

3 结 论

以甘薯淀粉为原料，依次经过羧甲基化、槲皮素共价结合两步改性，得到新型变性淀粉槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯。研究发现，产物的槲皮素取代度受底物配比（N槲皮素/AGU）、活化剂与淀粉配比（NEDC/AGU）和反应体系pH值的控制。获得制备槲皮素-羧甲基甘薯淀粉酯的最佳参数条件为N槲皮素/AGU2∶1，NEDC/AGU1.8∶1、反应体系pH 7.4，制备得到的产物槲皮素的取代度为0.114 9。