响应曲面法优化超声波辅助提取艾叶中总黄酮的工艺研究

蔡 敏

(广西现代职业技术学院资源工程系，广西 河池 547000)

引 言

艾叶(folium artemisiae argyi )，别名大艾叶、杜艾叶、蒌蒿，为菊科植物艾的叶[1]，是一种分布广泛的多年生草本植物。现代药理实验表明黄酮类物质不但具有降血压、降血脂、缓解心血管疾病、抗菌消炎等作用，还具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力等生理活性作用[2]，被广泛地应用于医药、食品等领域。

目前已有不少学者对植物中黄酮类化合物的提取方法作了研究，黄酮类化合物的提取方法有微波提取法[3]、溶剂提取法[4]、酶解法[5-6]、超声波提取法[7]等。与其他方法相比，超声波提取黄酮类物质，是目前比较新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜艾叶，采于广西河池市；芦丁对照品，成都曼思特生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯。

1.2 实验设备

KQ2200B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SD101-2电热鼓风干燥箱，南通金石实验仪器有限公司；RE52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；电子天平，常州市衡正电子仪器有限公司； SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；UV-1800-PC-DS2分光光度计，上海美谱仪器有限公司；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 艾叶总黄酮超声提取方法

准确称取2.000 g用高速万能粉碎机粉碎后的艾叶干粉，按一定液固比加入一定体积分数的乙醇水溶液，浸泡24 h；在超声波清洗器中超声提取一定时间，抽滤，将提取液用旋转蒸发仪减压浓缩，除去溶剂。

1.4 紫外分光光度法测定总黄酮含量

1.4.1 芦丁标准溶液的配置

准确称取芦丁对照品20 mg，置于50 mL烧杯中，用60%乙醇水溶液(体积分数，下同)溶解，并转入100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度为0.2 mg·mL-1的标准溶液。

1.4.2 芦丁回归方程的建立

参照文献[8]，采用NaNO2-Al(NO3)NaOH显色体系进行显色，以试剂空白作参比，在波长510 nm处测定吸光度值，以质量浓度C(mg·mL-1)为纵坐标， 吸光度A为横坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归，得芦丁溶液质量浓度C(mg·mL-1)和A关系曲线的回归方程为：C=0.090 9A-0.000 145，R2=0.999 8。

1.4.3 总黄酮含量的测定

将1.3中的浓缩液转移到100 mL的容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度。精密量取1.0 mL艾叶黄酮提取液，采用NaNO2-Al(NO3)NaOH显色体系进行显色分析[8]，以空白试剂为参比溶液测定其在测定波长510 nm处的吸光度值，根据标准曲线线性回归方程式计算出提取液中的黄酮浓度，再换算成处理后的艾叶中总黄酮含量。

1.5 单因素实验

称取2.000 g艾叶，固定乙醇体积分数、超声波提取时间、液固比、提取温度其中的一个因素，考察其他因素对艾叶中总黄酮提取率的影响。

1.6 Box-Behnken实验

在单因素实验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理设计自变量，以艾叶总黄酮提取率为响应值，通过响应曲面分析进行超声波辅助提取艾叶中总黄酮条件的优化。

1.7 验证实验

利用响应面软件分析进行实验，分别测定总黄酮含量，将实验结果与实验方案相比较，得到黄酮实际平均含量。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对艾叶总黄酮提取率的影响

称取2.000 g艾叶样品，按20∶1(mL∶g)的液固比分别加入不同体积分数的乙醇溶液，浸泡24 h；在超声波清洗器中于40 ℃超声提取60 min，不同体积分数乙醇对艾叶总黄酮提取率的影响结果见表1。

表1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由表1可以看出，艾叶总黄酮的含量开始随乙醇浓度的增大而增加，当乙醇体积分数达到60%时，总黄酮提取率达到最大，再增加乙醇体积分数，艾叶中非极性物质溶解度增大，总黄酮提取率下降，故选用乙醇体积分数为60%。

2.1.2 提取时间对艾叶总黄酮提取率的影响

称取2.000 g艾叶样品，按20∶1(mL∶g)的液固比加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超声波清洗器中于40 ℃提取不同时间， 提取时间对艾叶总黄酮提取率的影响结果见表2。

表2 提取时间对总黄酮提取率的影响

由表2可以看出，总黄酮含量随着超声波作用时间的延长增加。当提取时间达到60 min后，总黄酮提取率增加缓慢，故选用提取时间60 min～70 min。

2.1.3 液固比对艾叶总黄酮提取率的影响

称取2.000 g艾叶样品，分别按不同液固比(mL/g)加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超声波清洗器中于40 ℃提取60 min，不同液固比对艾叶总黄酮提取率的影响结果见表3。

表3 液固比对总黄酮提取率的影响

由表3可以看出，料液比达到20∶1时，总黄酮的提取率较高，再增加溶剂量，提取率增加不大，故选取液固比为20∶1～25∶1。

2.1.4 提取温度对艾叶总黄酮提取率的影响

称取2.000 g艾叶样品，按20∶1(mL：g)的液固比加入60%乙醇溶液，浸泡24 h；在超声波清洗器中不同温度下提取60 min，不同提取温度对艾叶总黄酮提取率的影响结果见表4。

表4 提取温度对总黄酮提取率的影响

由表4可以看出，提取温度在40 ℃～50 ℃总黄酮提取率较高。

2.2 提取工艺的响应面法优化

2.2.1 响应面实验设计及结果

综合单因素实验结果，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，选取乙醇体积分数、提取时间、液固比、提取温度对艾叶总黄酮的提取率影响显著的4个因素，在单因素的基础上，采用4因素3水平的的响应面分析法进行实验设计，设计表及结果见第9页表5。

2.2.2 模型的建立及显著性检验

利用Design expert V8.0.6统计软件通过逐步回归对表5实验数据进行回归拟合，得到得率对以上3个因素的二次多项回归模型为：

提取率=9.13+0.20A-0.23B-0.067C-0.042D+0.22AB-0.25AC-0.27AD-0.50BC-0.19BD-0.46CD-1.07A2-0.63B2-1.22C2-1.01D2

对该模型进行方差及显著性分析，得出回归模型系数显著性结果，见第9页表6。

由方差分析表(表6)可见，模型具有显著性，该模型的R2=0.9687，说明与实际实验拟合较好，因此可用该模型对艾叶中总黄酮工艺结果进行分析和预测。

表5 响应面实验设计及结果

表6 响应面二次回归方程方差分析

2.2.3 响应曲面分析

根据回归方程，作响应曲面图，见图1～图2及第10页图3～图4。等高线形状表示两因素交互关系强弱，如为椭圆形，说明两因素交互影响极显著。比较4组图并结合表6可知，乙醇体积分数(A)、提取时间(B)达到了极显著水平(P<0.01)，二次项中所有因素都是极显著的，在交互项中，乙醇体积分数(A)与提取时间(B)、提取时间(B)与提取温度(D)没有显著性(P>0.05)，提取时间(B)与液固比(C)、液固比(C)与提取温度(D)对提取率(Y)均有极显著性影响(P<0.01)，乙醇体积分数(A)与液固比(C)、乙醇体积分数(A)与提取温度(D)对提取率(Y)有显著影响(P<0.05)。

图1 乙醇体积分数(A)与液固比(C)对艾叶总黄酮提取率影响的响应图和等高线

图2 乙醇体积分数(A)与提取温度(D)对艾叶总黄酮提取率影响的响应图和等高线

图3 提取时间(B)与液固比(C)对艾叶总黄酮提取率影响的响应图和等高线

图4 液固比(C)与提取温度(D)对艾叶总黄酮提取率影响的响应图和等高线

2.3 验证实验

为检验响应曲面法所得结果的可行性，采用优化后的提取条件对艾叶总黄酮进行提取，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺参数修正为乙醇体积分数60%，提取时间60 min，液固比为20∶1，提取温度为40 ℃，经过3次平行实验，总黄酮的提取率分别为9.18%，9.12%，9.15%。

3 结论

利用软件Design-Expert8.0.6，通过响应曲面分析，得到了各因素的最佳范围：乙醇体积分数为60%，提取时间为60 min，液固比为20∶1，提取温度为40 ℃。验证实验结果表明，超声波法提取艾叶中总黄酮的提取率为9.15%。实验为艾叶中提取总黄酮的工业化生产提供了一定的理论基础，为开发利用广西丰富的中药材资源起到积极的促进作用。