普洱茶对大鼠肥胖的干预和保肝护肝作用

吴雅倩，陈亚蓝，+，冯 伟，郭志鹏，王雪青，* ，宋文军，白小丽，李长文

(1.天津市食品与生物技术重点实验室，天津商业大学，生物技术与食品科学学院，天津300134;2.云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司，云南普洱665100)

肥胖是一种多基因、多因素的复杂疾病，其本质是能量摄入大于消耗。多余的脂肪酸和葡萄糖在脂肪细胞合成三酰甘油，并以脂滴的形式贮存在细胞内部，当三酰甘油含量超过一定限度，就会发展为肥胖。肥胖引发的脂质代谢异常及代谢综合征可造成肝脂肪变性、肝功能损坏，导致肝炎、脂肪肝、肝纤维化，更严重的会增加2型糖尿病和心脑血管疾病的发病率［1－2］，因此，控制体重在适当的范围，是主动保持健康的最安全有效的方法。然而，一些减肥药物，如他汀类、贝特类、胆汁酸螯合剂类，会造成肠胃不适、肝脏毒素等不良反应［3］，运动减肥难于持久。据报道，天然植物，包括普洱茶［4－6］、葡萄籽中的白藜芦醇［7］、黄酮类物质［8］，具有减肥、降脂、降糖的功效，同时由于其毒副作用小，受到广泛的关注。因此，利用一些药食同源的具有减肥作用的天然植物，通过饮食进行干预，是预防肥胖的最佳途径之一。

普洱茶已被证实有良好的减肥降脂作用功效［9－10］，研究所采取的模型常常是先构建动物的肥胖模型，再给予普洱茶干预。然而，食品特别是保健品与药物有着本质的区别，前者对应的是健康人群，而后者对应的患病人群。因此，采用正常动物模型研究普洱茶的保肝护肝作用与其实际应用的场合更贴近，然而，关于其预防肥胖和保肝护肝方面的研究很少，特别是正常体重人群服用普洱茶的保健预防作用及作用机理尚未完全阐明。因此，本实验以正常的SD大鼠为模型，通过普洱茶干预高脂饲料喂养的SD大鼠后，测定大鼠肝脏中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量变化、脂质代谢相关酶和转录因子的mRNA转录水平及蛋白的表达水平的变化，探讨普洱茶在预防肥胖保肝护肝中的作用效果及作用机制，为普洱茶作为保健饮品的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成年雄性SD大鼠 SPF级、雄性、50只，体重160～170 g/只，许可证编号:SCXK－(军)2012－0004，购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心;基础饲料 配方为:玉米36.9%、小麦15.5%、麸皮15.5%、花生饼9.5%、豆粕15.5%、鱼粉4.5%、维生素0.1%、矿物质添加剂2.5%;高脂饲料 配方为:基础饲料59.25%、猪油20%、蔗糖10%、蛋黄粉8%、全脂奶粉2%、酵母粉0.5%、维生素0.1%、微量元素0.15%，冰冻储存，生产许可证编号:SCXK－(军)2002－018，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心;普洱茶干粉 主要成分为茶色素(49.44%，其中茶褐素占47.32%)、蛋白质(25.75%)以及多糖(16.74%)，云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供;Bradford蛋白浓度测定试剂盒、50×TAE、还原型 5×SDS上样缓冲液、30%Acr－Bis(29∶1)、0.5 mol/L Tris－HCl(pH=6.8)溶液、1.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.8)溶液 北京索莱宝科技有限公司;全蛋白提取试剂盒、引物合成 生工生物工程(上海)股份有限公司;p－AMPK单克隆抗体(兔抗鼠)、GAPDH多克隆抗体(兔抗鼠) 美国 Cell Signaling Technology公司;HRP标记山羊抗兔IgG 美国 Abbkine公司;DNA Ladder2000、DEPC－Treated Water 上海依科赛生物制品有限公司;Gene Green核酸染料 天根生化科技(北京)有限公司;Ribonulease Inhibitor、Agarose－ molecular Biology Grade、Trizol Reagent、M－ MLV Fist Strand Kit、SYBR Select Master Mix，life technologies;显、定影液 天津世纪奥博商贸有限公司;Western发光检测试剂盒 威格拉斯生物技术(北京)有限公司;TG、TC试剂盒 南京建成生物总公司。

3－18K高速离心机 美国 Sigma公司;FHC－1200A超净工作台 北京国仪合信商贸有限公司;SPECTRAMAX－M5酶联免疫检测仪 美国MD公司;UV－1紫外透射分析仪 珠海黑马医学仪器有限公司;DYY－4C电泳仪 北京六一仪器厂;chemiDocTmXRS凝胶电泳成像仪 美国BIO－RAD;StepOnePlusTm Real－Time PCR System 美国Applied Biosystem公司;T100Tm Thermal Cyler Pcr仪 美国BIO－RAD;UV－2550型半微量紫外分光光度计 SHIMADZU;Mini PRORTEAN Tera Cell电泳槽、TRANS－BLOT SD SEMI－DRY TRANSFER CELL 半干电转仪 BIO－RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 将SD大鼠饲养于SPF级动物实验室，饲养时相对湿度40%～70%，温度19～26℃，用基础饲料适应性喂养7 d后，随机分为5组:正常对照组、高脂对照组、普洱茶低浓度组、普洱茶中浓度组、普洱茶高浓度组，每组10只。分组后，正常对照组继续用基础饲料喂养，另外4组自由采食高脂饲料喂养，各组动物在实验期间自由采食、自由饮水。同时，等体积的普洱茶以低、中、高浓度分别给予0.45、0.90、1.35 g/kg剂量干预，而正常对照组和高脂对照组灌胃等量自来水，灌胃量为0.2 mL/10 g。每日上午 9 点灌胃一次，连续 12 周［6，11］。

1.2.2 实验样本收集 实验结束后，各组SD大鼠禁食24 h，解剖，取肝脏，用生理盐水清洗后称重，置于液氮速冻，最后将肝脏组织放入－80℃冰箱冷冻备用。

1.2.3 肝脏匀浆中TC和TG含量测定 按试剂盒说明制取肝组织匀浆，并测得TC和TG含量。

1.2.4 实时荧光定量PCR测定脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP－1c)、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)基因表达 按照文献［12］描述的方法稍作改动。即从－80℃冰箱保存的肝脏组织，剪取50～100 mg，放入液氮预冷的研钵内，加入液氮，迅速研磨成粉，利用Trizol试剂提取肝组织中总RNA，并于紫外分光光度计下测定260 nm和280 nm下的吸光度A值，两者比值为1.8～2.1之间，表示RNA纯度高，并于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。按照试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA并于20μL反应体系中，进行RT－PCR反应。取八连排Pcr管，加入SYBR Select Master Mix 10μL，cDNA 1 μL，上下游特异性引物各 0.6 μL(5μmol/L)，7.2 μL DEPC 水。先 95 ℃ 预变性2 min，然后95℃ 15 s、60℃ 1 min循环40次，结束反应。产物经熔解曲线和扩增曲线确认特异性。应用2－ΔΔCt法计算RNA相对表达量，以β－actin作为内参，测定基因及上下游引物分别为 β－actin:5'－CGTGAAAAGATGACCCAGATCA－3'，5'－CTCCGGAG TCCATCACAATG－3';FAS:5'－GGCATTATCTTGG AAGCGATGGGTA －3'，5'－AAACTGCTCAGGACTGCG TGGG－3';SREBP －1c:5'－GCTCACAAAAGCAAA TCACTGAAAG － 3'，5'－ GCGTTTCTACCACTTCAGG TTTCA－3';HMGCR:5'－ATTGCACCGACAAGAAA CCTGCTG－3'，5'－TTC TCTCACCACCTTGGCTGGAAT－3'。

1.2.5 Western Blot测定蛋白表达 参照文献［13］的方法稍作改动。利用蛋白提取试剂盒提取肝组织中蛋白，取样进行SDS－PAGE电泳(80 V，45～60 min后100 V至溴酚蓝到达凝胶底部，结束电泳)，用PVDF膜进行半干式电转(采用恒压20 V进行转膜，转膜时间 GAPDH，80 min;p－AMPK，90 min)，取出PVDF膜，置于5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗，4℃摇床孵育过夜(一抗稀释倍数1∶1000)，次日加入HRP标记山羊抗兔 IgG二抗(二抗稀释倍数1∶2000)，室温摇床孵育2 h，随后显色、曝光、显影、定影并于Gel－pro analyzer分析软件中进行灰度值分析。

1.2.6 数据处理与分析 数据采用平均值±标准差(珋x±s)表示，相关性和显著性分析SPSS 16.0完成。

2 结果与分析

2.1 普洱茶对肝脏中TG含量的影响

由图1可知，大鼠经12周的喂养后，高脂组大鼠肝脏中TG含量较正常对照组相比极显著上升(p＜0.01)，与高脂组相比，普洱茶低浓度处理组肝脏中TG含量下降显著(p＜0.05)，而中、高浓度处理组肝脏中TG含量下降极显著(p＜0.01)。结果表明，在实验浓度范围内，普洱茶能有效地降低高脂喂养大鼠肝脏中的TG含量，且作用呈剂量依赖关系。

图1 普洱茶对大鼠肝脏中TG含量的影响Fig.1 Effect of Pu－erh tea on TG content in rat liver注:##:与正常对照组相比差异极显著(p＜0.01);#:与正常对照组相比差异显著(p＜0.05);＊＊:与高脂对照组相比差异极显著(p＜0.01);*:与高脂对照组相比差异显著(p＜0.05);图2～图6同。

2.2 普洱茶对肝脏中TC含量的影响

由图2表明，高脂对照组大鼠肝脏中TC含量水平较正常对照组极显著升高(p＜0.01)。与高脂对照组比较，普洱茶处理组TC含量呈现下降趋势，低、中浓度的普洱茶组差异不显著(p＞0.05)，而高浓度普洱茶组，TC含量由0.186 mmol/g下降到0.11 mmol/g，差异显著(p＜0.05)。但高浓度普洱茶组大鼠肝脏中TC含量与正常对照组相比仍有上升，且差异显著(p＜0.05)。结果表明，普洱茶可以改善高脂饲喂大鼠的肝脏内TC含量，但达不到正常水平。

图2 普洱茶对大鼠肝脏中TC含量的影响Fig.2 Effect of Pu－erh tea on TC content in rat liver

2.3 普洱茶对大鼠肝脏中 FAS、SREBP－1c、HMGCR表达水平的影响

普洱茶对大鼠肝脏中FAS表达水平的影响见图3。高脂对照组大鼠肝脏中FAS表达水平较正常对照组提高了280.4%，差异极显著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高浓度组的FAS表达水平随普洱茶浓度的提高出现不同程度的下调作用，且与高脂对照组相比，差异极显著(p＜0.01)，特别是高浓度处理组FAS表达水平显著(0.932)低于正常对照组。表明普洱茶可以降低大鼠肝脏FAS的表达水平，从而减少肝脏中脂肪酸的合成，有效预防肥胖。

图3 普洱茶对大鼠肝脏中FAS表达水平影响Fig.3 Effect of Pu－erh tea on the expression level of FASin rat liver

普洱茶对大鼠肝脏中SREBP－1c表达水平的影响见图4。高脂对照组大鼠肝脏中SREBP－1c表达水平较正常对照组提高了262.9%，差异极显著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高浓度组大SREBP－1c表达水平随普洱茶浓度的提高出现不同程度的下调作用，且与高脂对照组相比，差异极显著(p＜0.01)，低、中、高浓度普洱茶对大鼠肝脏中SREBP－1c的表达水平(分别为1.163、1.019、1.015)，与正常对照组没有显著差异(p＞0.05)。表明普洱茶可以降低大鼠肝脏SREBP－1c的表达水平，从而下调脂质代谢相关因子和酶的表达水平。

图4 普洱茶对大鼠肝脏中SREBP－1c表达水平影响Fig.4 Effect of Pu－erh tea on the expression level of SREBP－1c in rat liver

HMGCR是胆固醇固醇合成途径上关键限速酶。普洱茶对大鼠肝脏中HMGCR表达水平的影响见图5，高脂对照组大鼠肝脏中HMGCR表达水平较正常对照组提高了3.42倍，差异极显著(p＜0.01)。普洱茶低、中、高浓度组HMGCR表达水平随普洱茶浓度的提高出现不同程度的下调作用，且与高脂对照组相比，差异极显著(p＜0.01)，普洱茶低、中和高浓度对大鼠肝脏中HMGCR的表达水平与正常对照组没有显著差异(p＞0.05)。表明普洱茶可以降低大鼠肝脏HMGCR的表达水平，从而有效减少胆固醇在肝脏中的合成，减轻肝脏负担。

图5 普洱茶对大鼠肝脏中HMGCR表达水平影响Fig.5 Effect of Pu－erh tea on the expression level of HMGCR in rat liver

2.4 普洱茶对大鼠肝脏中腺苷酸活化蛋白激酶蛋白(p－AMPK)表达水平的影响

甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解反应中的一个酶，广泛分布于各种组织中的细胞检测以及作为Western Blot蛋白质标准化的内参［14］。普洱茶对大鼠肝脏中p－AMPK蛋白表达水平的影响见图6。高脂对照组大鼠肝脏中p－AMPK蛋白表达水平较正常对照组降低了59.71%，差异显著(p＜0.05)。普洱茶低、中、高浓度组p－AMPK蛋白表达水平随普洱茶浓度的增加而提高，且与高脂对照组对比，差异显著(p＜0.05)，具有剂量－效应性。普洱茶低、中、高浓度组对大鼠肝脏中p－AMPK蛋白表达水平均高于正常对照组。AMPK是预防肥胖、治疗脂质代谢紊乱的重要研究靶点，其能调控机体内能量代谢，是调控多个脂肪和成和胆固醇合成相关酶的上游影响因子。本研究表明，普洱茶能激活AMPK蛋白磷酸化，继而增强分解代谢。

图6 普洱茶对大鼠肝脏中p－AMPK表达水平影响Fig.6 Effect of Pu－erh tea on the expression level of p－AMPK in rat liver注:大鼠肝脏中GAPDH、p－AMPK蛋白表达的比较(灰度);ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ分别为正常对照、高脂对照、低浓度、中浓度、高浓度组。

3 讨论

SREBP－1c是脂肪合成有关基因转录的决定因子，SREEP－lc的活化可促进FAS等成脂基因转录，从而参与脂肪细胞分化、增殖及机体脂质代谢的病理生理调节［15－16］。刘姚等［17］在研究青钱柳多糖对高脂血症小鼠脂肪酸合成酶表达影响时发现，青钱柳多糖具有抑制高脂血症小鼠FAS基因和蛋白质表达的作用。表明青钱柳多糖通过降低FAS基因和蛋白质表达降低高脂血症小鼠血脂和血糖的含量。张谷等［18］在研究高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪性肝病进展中肝脏脂代谢关键调控基因表达的变化时发现，与正常组相比，4、8和12周3个时间点的高脂大鼠中，SREEP、FAS、ACC mRNA表达水平逐渐增加。表明高脂饮食可诱导肝组织 SREBP－1c表达增高，过度表达的SREBP－1c引起其调控的脂肪合成相关基因ACC、FAS等活性升高，使脂肪酸合成异常增多。在本实验中高脂组大鼠肝脏中FAS和SREBP－1c的表达显著高于正常对照组，经处理组均能降低其表达水平，减少TG含量(图1)。表明普洱茶能够降低SREBP－1c及其目标基因FAS的表达，从而抑制肝脏中脂肪酸的吸收及合成。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是胆固醇合成途径的限速酶，AMPK激活后使HMGCR的ser871位磷酸化失活，导致胆固醇合成减少［19－20］。王会玲等［21］研究小檗碱改善糖尿病鼠糖代谢及胰岛素抵抗作用及对骨骼肌线粒体功能的影响和机制时发现，小檗碱给药3周后，db/db小鼠的体重和脂肪垫重量均显著降低，血糖水平下降，并使AMPK磷酸化水平显著激活。表明小檗碱的降糖、降脂作用与激活 AMPK有关。陈彪等［22］研究黄连碱对胆固醇代谢关键基因的调节作用时发现，黄连碱能下调 HMGCR的mRNA和蛋白表达水平，降低TC、LDL－c水平。表明黄连碱通过下调胆固醇代谢的关键基因HMGCR的mRNA和蛋白表达而达到降胆固醇的效果。本实验中高脂对照组大鼠肝脏中HMGCR基因表达上升，而p－AMPK蛋白表达较正常正常对照组显著降低，在普洱茶干预下，HMGCR基因的表达下调，p－AMPK蛋白水平显著提高，从而减少了TC含量(图2)。因此，说明普洱茶能降低内源性胆固醇合成，预防肥胖。

4 结论

普洱茶干预高脂饲料喂养的SD大鼠能有效提高其肝脏组织中AMPK的磷酸化水平，一方面下调SREBP－1c和FAS的转录水平达到降低肝组织TG含量的作用，另一方面抑制HMGCR的转录水平减少TC在肝组织中的合成和蓄积，从而预防肥胖，维持肝脏正常的脂质代谢功能，减少肝炎和非酒精性脂肪肝的发生率，有效地保肝护肝。