乳清蛋白水解物的研究进展及应用

孙景珠，赵丽双，刘丽波，李 春，*

(1.泰安市食品药品检验检测中心，山东泰安271000;2.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)

乳清是在生产干酪及干酪素过程中，除去酪蛋白沉淀后所得的物质，具有很高的营养价值。乳清直接烘干所得的乳清粉中，乳清蛋白所占含量一般为百分之十几，不超过百分之三十［1］。乳清蛋白是一种优质蛋白，常被用作人体优质蛋白补充剂，素有“蛋白质之王”之称，它不仅易被消化吸收，而且还含有多种活性成分［2］。乳清蛋白的许多功能性质，如成胶性、持水性、搅打起泡性、乳化性、涂层性、微胶束化等在食品中均有广泛的应用［3］。乳清蛋白虽有很多优点，但由于它是大分子蛋白，在肠道中需经水解成短肽和游离氨基酸后方可被吸收，且对热、酸敏感，易变性，变性后溶解度降低，限制了它在食品中的应用［4－5］。而乳清蛋白水解物则是乳清蛋白经水解后得到的产物，其大部分构成成分是小肽及氨基酸，改善了乳清蛋白对热酸的敏感性。大多数学者研究表明，乳清蛋白经水解后还会释放出一些具有特定活性的氨基酸序列，即活性肽，它们具有特殊的生理功能［6］。随着对乳清蛋白水解物研究的不断深入，它在食品中的应用也越来越多样化。因此，本文系统地概述了乳清蛋白水解物的制备，生物活性，并对乳清蛋白水解物在食品领域的应用进行了论述，以利于乳清蛋白水解物的进一步开发与应用。

1 乳清蛋白水解物的制备

1.1 化学水解法

化学法包含酸水解和碱水解。酸水解通常利用HCl溶液作为水解剂，该水解反应剧烈，谷氨酰胺和天冬酰胺被完全水解，丝氨酸只有部分被水解，而色氨酸则被完全破坏;碱水解一般用KOH溶液、NaOH溶液，这种水解法会破坏氨基酸产生氨气，且易变旋［7］。

化学法虽水解较完全，但反应剧烈，对氨基酸破坏性大，重复性差，产物杂，且不易控制水解度，通常不采用此种方法。

1.2 酶解法

酶解法是采用特定蛋白酶在最适温度和pH下对乳清蛋白进行的酶解反应，它反应条件温和，反应特异性强，且制酶工艺不断成熟，蛋白酶资源丰富，成本低，故酶解法是最常用的一种水解方法［8］。酶解法所得到的产物是肽段，不会破坏氨基酸的结构，营养价值更高，更易被人体吸收。

酶解法产生的肽段具有许多的生物功能，目标功能不同，所选择的蛋白酶种类，酶解条件及水解度均不同。石丹等［9］以低致敏性为指标，采用碱性蛋白酶，研究了乳清蛋白水解的工艺条件，发现在酶解温度60℃，pH9.0，加酶量19000 U/100 mL，酶解时间4 h时，抗原残留量最低，为原料的5%，此时水解液的水解度为16.0%。钟兴业［10］利用自制的固定化中性蛋白酶进行水牛乳抗氧化活性肽的研究，在最适条件，温度55℃，p H7.5，加酶量2000 U/g，酶解5 h时，水解产物的DPPH自由基清除率可达到65.24%。

酶的种类对酶解效果及最终产物都有较大影响，常用的酶的种类有木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶等。由于每一种酶都有特定的酶切位点，不同酶作用乳清蛋白，所得酶解产物及水解度均不一致。复合酶水解法即是利用这一特点，利用两种及两种以上蛋白酶同时作用在乳清蛋白上，对其进行限制性水解。这种水解方式不仅使蛋白水解率得以提高，而且还赋予所得肽段更多生理功能［11］。Lakshman 等［12］以胰蛋白酶、胃蛋白酶和从红曲霉中提取的两种酸性蛋白质Mpi AP1，Mpi AP2为水解用酶，对乳清蛋白分别进行了单一酶解和复合酶解，研究发现，复合酶解更利于乳清蛋白水解，能更大程度提高乳清蛋白酶解物的水解度。Wang［13］等利用碱性蛋白酶－中性蛋白酶对乳清蛋白进行酶解，结果表明，水解产物与单一酶解相比，血管紧张素转换酶(angiotensin convert enzyme，ACE)抑制能力最高，产物的灰分含量最低。

随着研究的深入，一些新型的酶解方法逐渐进入人们视野，超高压水解乳清蛋白和微波辅助酶解乳清蛋白是两种较常用的物理辅助酶解法［14］。这两种酶解法在传统酶解基础上，整合超高压和微波技术，极大的提高了酶解反应速率，缩短了反应时长，并且改善了产物特性，增加了多肽和氨基酸的产率，降低了能耗，是一种高速高产节能环保的酶解方法。

1.3 微生物发酵法

微生物发酵法与酶解法类似，都是利用蛋白酶对乳清蛋白进行水解，但与酶解法不同的是，蛋白酶来自微生物发酵过程。微生物发酵法可达到较高的水解度，故适用于低聚肽的生产，可降低成本，并且微生物中所含有的肽酶，可以消除苦味肽，赋予产品良好风味。

乳酸菌是微生物发酵过程中的常用菌种，生长过程中需要多肽和氨基酸作为营养物质，生长后会分泌蛋白酶将环境中的蛋白质水解。郭宇星［15］对微生物发酵法水解乳清粉制备生物活性肽进行了研究，以瑞士乳杆菌TS2005为发酵菌株，以发酵液为原料生产ACE抑制肽，并确定最佳发酵条件及工艺路线。Li等［16］同样利用微生物法，采用克鲁维酵母菌Z17发酵牛乳，从而获得ACE抑制活性肽，并利用响应面法得出发酵温度是影响多肽生物活性的一个重要因素。

1.4 亚临界水水解法

亚临界水是指水的状态处于沸点以上，临界点以下的液态，这个状态需要加热和加压维持，这种状态的水也叫高压热水、高温水和过热水［17］。这种水解方法是以水为介质，在高温高压下水分子会裂解使得离解常数增大，促进乳清蛋白水解，效果等同于双催化剂水解或者酸碱水解，是一种很有效的水解方法。

研究发现［1，18，21，38］，这种水解方法有如下优点:水解效率高，价格便宜，无需使用水解酶及有害试剂，安全可靠。但其水解时间和温度会影响其水解度，可通过控制这些因素来控制产物品质。

2 乳清蛋白水解物的生物活性

2.1 低致敏性

由于牛乳和母乳中蛋白结构有较大差异，母乳中乳清蛋白约为70%，而牛乳中乳清蛋白含量仅为21.5%［1］，故生产婴幼儿配方粉时经常添加脱盐乳清粉以作调整。乳清蛋白虽然营养价值高，但其中含有的α－乳白蛋白和β－乳球蛋白具有致敏性，婴儿食用后会出现不用程度的致敏症状，轻者会引起鼻炎、腹泻、湿疹，重者则会引起胃肠出血［19］。乳清蛋白经蛋白酶水解后，其部分抗原决定片段也会随之被水解，从而降低其致敏性。用乳清蛋白水解物替代乳清蛋白是目前最常用的降低致敏性的方法。

试验发现［20］，经过筛选以中性蛋白酶为最佳水解用酶，水解度与β－乳球蛋白致敏性降低率不成正比关系，在温度为45℃，pH为7，E/S为2500 U/g，水解3 h时，致敏率降低最大，且水解后，持水性增强;Kim等［21］发现与用胰蛋白酶和胃蛋白酶单纯酶解浓缩乳清蛋白相比，用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同水解经热处理后的浓缩乳清蛋白，水解度更高，过敏原性降低更显著。

2.2 抗氧化性

抗氧化肽是一种从自然界生物中提取、化学合成或是通过降解蛋白质所得到的一种活性成分，它通常是作为供电子体或供氢体，或与金属离子鳌和来促进过氧化物分解和清除自由基，从而起到抗氧化作用［6］。人类的许多疾病如肥胖、心肌梗死、动脉硬化等都与自由基的氧化作用有关，适度摄入抗氧化肽有利于疾病的预防，还可以延缓衰老。乳清蛋白经酶解后的酶解液中也含有这种物质。抗氧化肽一般是从自然界中获取或是化学合成，但由于自然生物体中抗氧化成分含量低，有机溶剂残留多，提取成本高，而化学合成工艺价格高，产率低，安全性差，故这两种方法均不适合大量生产，蛋白质降解成为一个更有效的生产抗氧化肽的途径。

吴慧［22］以Alcalase 2.4 L碱性蛋白酶为最适酶，研究乳清蛋白抗氧化肽构效关系，酶解物经分离纯化得到八种抗氧化活性不同的肽段，分别是Arg－Val－Tyr、Ala－His－Leu－Trp、Gly－Thr－Ser－Val、Val－Phe、Try－Ser－Leu、Leu－Phe、Trp－Tyr－Ser－Leu、Val－Ala－ Gly－Thr－Ser－Val－Tyr，其中 Trp－Tyr－Ser－Leu自由基清除率最高，为87.90%(500μmol/L)。彭新颜等［23］通过研究水解物对硫代巴比妥酸值(TBARS)和过氧化值(PV)的抑制作用以及DPPH自由基清除能力等的分析，得出在底物浓度为5%时，添加2%的蛋白酶，水解5 h时抗氧化活性最强。

2.3 促乳酸菌增殖

对于蛋白肽促生长的研究，最初以大豆蛋白肽促乳酸菌增长的研究居多，直到近几年，随着对乳清蛋白水解物研究的深入，人们对乳清蛋白水解物可促乳酸菌增殖越来越认可。蛋白水解物能促进乳酸菌增殖是因为在乳酸菌生长过程中，相比于氨基酸，它们更喜欢利用短肽，故而富含短肽的蛋白水解物更利于乳酸菌生长［24］。乳酸菌虽然自身也产生蛋白酶，但其水解能力较弱，有研究发现乳清蛋白水解物促进效果优于大豆蛋白水解物［25］。

不同分子量大小的肽段对乳酸菌增殖作用不同，韦慧娟［26］研究发现酶解产物中分子量小于3 k Da肽段促干酪乳杆菌生长效果最好，还发现加入水解物的多少对其生长也有影响，当乳清蛋白水解物替代量为40%时，促生长作用最显著。高海燕［27］研究乳清蛋白水解物在培养基中的应用，将水解物以8 g/L的量替代MRS培养基中的蛋白胨，促生长效果较好;替代酵母粉，则不利于保加利亚乳杆菌的生长;双替代则接近或优于自配或市售MRS培养基，对嗜热链球菌和双歧杆菌培养效果最好;全替代氮源不利于保加利亚杆菌生长，其他菌种生长较好。

2.4 降胆固醇

目前有研究表明，许多蛋白酶解物所含的活性肽都能降低动物的血清胆固醇水平，对一些疾病如动脉粥样硬化，有一定的预防作用，其中由以酪蛋白和大豆蛋白研究较多，而对乳清蛋白研究较少。但这并不代表乳清蛋白水解物不具有降胆固醇能力，Nagaoka［28］从β－乳球蛋白的胰蛋白酶解液中分离出一种较为专一有效的降解胆固醇的生物活性肽，它的氨基酸序列是 Ile－Ile－Ala－Glu－Lys，这种肽的活性比当时一种降胆固醇的药物(β－谷甾醇)还要强。为了做进一步研究，高学飞［29］利用 CM－Sephadex C50为层析材料对酶解液进行筛选，得到目标活性肽，确定分子量大小为1～12 k Da，并进行动物实验，得出这种活性肽还具有降低血液中胆固醇、甘油三酯水平，减小动脉硬化指数，促生长及降低脂肪沉积的生物活性。现阶段，对于乳清蛋白源活性肽降胆固醇的机理仍不确定，降胆固醇肽仍有较大的研究空间。

2.5 降血压

高血压是现代人们常患的“三高”病之一，严重影响人们健康。传统的降压药大部分都是化学合成的，常期服用对人体的肾脏及尿酸代谢、脂肪代谢和糖代谢产生一定影响，停药后还会引起一系列综合症，所以对安全可靠的降压产品的需求越来越迫切。最初的天然抗氧化肽是从毒蛇中提取，而后发现乳清蛋白、大豆、玉米蛋白、大蒜、鱼肉都可以提取出降血压活性成分，乳清蛋白源的降压肽来自牛乳，是一种天然的降压活性分子［30］。

ACE是广泛存在各种组织中的膜结合蛋白，它对血压调节有一定作用。乳清蛋白水解物可以抑制ACE活性，从而起到降血压作用。于晓庆等［31］研究酶法制备乳源ACE抑制肽，确定在3%的用酶量、温度52℃、pH为7、底物浓度为4.5%，水解9.5 h时，制备效果最好，半抑制浓度(IC50值)为1.2063 mg/mL。为了验证抗氧化肽在体内的功效，徐思源［32］利用原发性高血压鼠进行动物实验，结果表明，在进食4 h后ACE活性最低，随后缓慢增加到近似原有血压水平，这说明乳清蛋白水解物降血压效果较稳定。

2.6 降血糖

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，也是富贵病中的一种，分为1型和2型糖尿病，表现症状为高血糖，2型糖尿病有较大的遗传特性，严重影响人们生活［33－34］。目前，有研究表明，食源性的降血糖活性成分可从菜籽、牡蛎、杂色蛤、蚕蛹、杨梅等中提取，但对乳源的降血糖成分的研究并不是很多［35－37］。徐庆等［38］在这方面进行了研究，他们用水解度为14.8%的乳清蛋白酶解物喂食KKAy小鼠，结果表明小鼠血糖有所降低，并且灌胃半小时后的胰岛素水平明显提高。

2.7 促进矿物质吸收

乳清蛋白水解物中能与矿物质元素鳌合，并进一步促进矿物质吸收的物质称为促矿物质吸收肽，它的中心位置有谷氨酰残基和磷酸化的丝氨酸基团，能与金属离子例如钙、铁、锌结合，待机体需要时，会缓慢释放出金属离子，以供机体所需［39］。近年来，对促钙离子吸收的乳清蛋白源肽研究较多。肖姗［40］对乳清蛋白鳌合肽进行研究，发现肽钙质量比，温度，溶液pH都会影响钙离子鳌合率，当肽钙质量比为1∶5，多肽溶液初始 p H为10.5，65℃下反应50 min时，效果最佳，此时鳌合率为7.45%。郭丽丽等［41］研究发现，乳清蛋白酶解可制备促钙离子吸收肽，当水解液中氨基氮含量为0.272 mg/mL时，产生的肽具有最强的体外持钙活性。

2.8 其他特性

乳清蛋白水解物除具有以上功能特性外，还具有提高记忆力、抗菌、抗肿瘤、免疫调节等作用［42］。卞辑［8］为研究乳清蛋白水解物的提高记忆力，抗衰老等功效，对灌食乳清蛋白肽的衰老小鼠进行行为学研究，结果发现，衰老小鼠在跳台、暗箱中躲避电击以及水迷宫定位航行实验中，都较对照组有更好的表现，这说明乳清蛋白水解物对小鼠有提高记忆功效;柯德森等［43］在研究乳清蛋白水解程度与抗菌能力的关系时，水解程度小于12 mg氨基酸/mL时呈正相关，水解程度大于12 mg/mL时呈负相关，在10～12 mg/mL时抗菌能力最强。对于乳清蛋白水解物抗肿瘤、免疫调节作用研究的不多，需进一步探索。

3 乳清蛋白水解物在食品中的应用

3.1 在饮料中的应用

我国饮料产品除碳酸饮料、果蔬饮料及功能性饮料外，蛋白饮料逐渐成为人们关注的热点［44］。乳清蛋白水解物中含有多种活性肽，易吸收且对人体有诸多益处;而饮料销量大，食用方便，可接受性强，故而乳清蛋白水解物的应用较为广泛。马平［45］将乳清蛋白肽与营养丰富的人参提取液结合起来，研制出一款人参乳清蛋白多肽饮料，长期服用有诸多好处，不仅能提高免疫力，还能延缓衰老，降血糖。随后乳清多肽茶饮料、菠萝乳清多肽饮料、乳清多肽果汁饮料也应运而生［46－48］。

由于乳清蛋白经水解后会有苦味肽产生，口味差，如何去除苦味肽也是一项重要的研究内容。何光华［49］在研究蛋白苦味肽修饰时发现，通过转换蛋白酶不能解决苦味肽的问题，但是将乳清发酵的水解液与发酵液按1∶1配比，所得到的饮料没有苦味，且色泽呈乳白色。

3.2 在乳制品中的应用

3.2.1 在酸奶中的应用 在酸乳生产过程中，使用直投式发酵剂的比例逐渐增大，由于近年来，人们更加注重养生，而酸乳营养丰富，故其销售量逐年增加。酸奶的发酵时间一般是在4～6 h，如何缩短酸乳发酵时间，降低生产成本，是近年来的一个研究热点。乳清蛋白水解物由于其蛋白分子量小，多为小肽和氨基酸，更易被乳酸菌利用，故而可以用于酸奶生产中［50］。曲杜娟［51］以同种酶不同水解度和不同酶同一水解度的乳清蛋白水解物等量替代奶粉用于酸奶发酵，结果表明，用Flavourzyme和Alcalase碱性蛋白酶水解，添加3%的水解物可缩短发酵时间12%左右，小于3 kDa的组分更易促酸奶发酵，并且储藏31 d后，其表观粘度增加6.5%，且与空白相比，酸化程度较低。乳清蛋白水解物可以促乳酸生长，故也可用于酸奶发酵剂的改良。白凤翎［52］研究发现，蛋白水解物对嗜热链球菌促生长效果要好于保加利亚乳杆菌，添加酵母膏，菌数可增长1.0～1.5个数量级。可见乳清蛋白水解物对酸奶发酵剂产业也有一定的推动作用。

3.2.2 在婴儿配方奶粉中的应用 婴儿配方奶粉中需要添加乳清蛋白以调节乳清蛋白与酪蛋白的比例，以适合婴儿所需。乳清蛋白中的α－乳白蛋白和β－乳球蛋白，因其具有过敏表位，而成为牛乳中的主要过敏原。将乳清蛋白水解后添加，可以降低致敏性。不同水解度有不同功效，完全水解配方粉，也就是氨基酸配方奶粉，用于重度牛奶蛋白过敏婴儿，主要产品有雀巢恩敏舒、美国纽康特;深度水解配方粉适用于中轻度牛乳蛋白过敏婴儿或是重度六个月转轻度，产品主要有澳洲爱他美、荷兰纽太特、荷兰牛栏;部分水解配方粉用于预防过敏反应的发生，主要产品有雀巢超级能恩，美赞臣亲舒。低敏奶粉水解度越高，味道丧失越多，口感越差。有研究表明［53］，完全水解的牛乳蛋白配方粉中含有大量游离氨基酸，95%以上肽段分子质量应低于3 kDa;深度水解的配方粉中含有80%～85%的短肽及游离氨基酸，肽段分子质量位于3～10 k Da之间;部分水解的配方粉中含有多肽，分子质量相对于深度水解较大，但大部分仍处于3～10 k Da之间。赵红霞［54］用水解蛋白部分替代原有蛋白质，制成一种低敏性婴儿配方粉，然后对它的感官性质及营养成分进行分析，发现与原配方粉并无异常，但却具有低致敏性。

3.2.3 在干酪中的应用 干酪是以鲜乳为原料，加入发酵剂与凝乳酶，蛋白质凝固后排乳清，经成熟后得到的发酵制品，含有多种维生素及矿物质。它的成熟期很长，以切达干酪为例，大约是6～12个月，成熟成本高。一般用物理、化学、生物方法使蛋白质和脂肪降解成易被乳酸菌利用的小分子，从而加速发酵，缩短时长。曹岩［55］研究了乳清肽对快速成熟干酪质量特性影响，乳清蛋白肽通过促进乳酸菌增殖，从而促进干酪成熟，研究发现，当水解至乳清肽的分子量为3 k Da，添加量为2%时，促成熟效果最好，检测各项指标，均达到成熟标准。

3.3 在肉制品中的应用

早在多年前，就有研究表明，乳清蛋白可以被用在肉制品生产中，主要是为了提高肉制品中蛋白质含量，增加肉的持水性，改善肉的切片性［56］。同样，乳清蛋白水解物也可以用于肉制品加工中，这主要是利用乳清蛋白水解物的抗氧化性。许柳［6］研究了乳清蛋白酶解物在冷却鸭肉保鲜中的应用，他发现，乳清蛋白水解物的抗氧化性在低温和酸性条件下发挥的更好，将其用于冷却鸭肉保鲜中，能明显的抑制脂肪氧化，添加10%的酶解液，保鲜效果最好。同样的，彭新颜［57］发现，乳清蛋白水解物同样适用于熟肉糜的保鲜中，添加2%的水解物的肉糜在贮藏中不仅红度值(a*)较对照组高，而且其抗氧化效果与添加0.02%的丁羟基茴香醚(butyl hydroxyl anisd，BHA)相当。

4 结论与展望

食源性蛋白肽是最近研究的一个热点，乳清蛋白水解物含有的多种活性肽也逐渐被发现和利用，这大大提高干酪副产物乳清的附加值。乳清蛋白水解物的制备方法已较为完善，一些高新技术正在逐步取代传统的制备方法。对于水解物的生物活性来说，其低致敏性、抗氧化性、促乳酸菌增殖这几方面研究较多，而对降血糖、降胆固醇、提高记忆力等方面研究较少，一些活性肽的作用机理尚未完善，有较大的研究空间。乳清蛋白水解物应用在饮料、乳制品、肉制品中较多，而在食品的其他方面，如焙烤食品、休闲食品、冷冻食品等却尚未开发。有研究表明［42］，乳清蛋白水解物可以用于保健食品的开发，虽有理论依据，但却无实际产品，日本对乳清蛋白肽的保健食品开发较多，但国内尚为空白。探讨限制乳清蛋白水解物应用的原因，一方面是由于酶解成本较高，另一方面是由于提取技术尚未成熟。相信随着研究的深入及乳清蛋白活性物质提取工艺的成熟，乳清蛋白水解物的生物活性必会被充分开发与利用，其产品在国内市场也必有广阔空间。