不同预处理对豆腐柴叶果胶理化性质的影响

张 攀，陈 信，熊双丽，2，* ，薛朝云

(1.西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，四川绵阳621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司，四川江油621700)

豆腐柴(Premna microphylla Turcz)是马鞭科豆腐柴属多年生落叶灌木，其叶子除具有基本营养成分外，还含有大量果胶，大约为 10% ～30%［1－3］。果胶是一种由半乳糖醛酸聚合而成的高分子物质，由于其良好的凝胶性、乳化稳定性，在食品、医药等多个行业被广泛应用。目前，市场上售卖的果胶主要以橘皮、苹果渣为原材料，其果胶含量为20%左右［4－5］。相比之下，豆腐柴叶果胶含量更高，且豆腐柴为野生植物资源，生长条件要求不高，生长迅速，原料丰厚，具有极大的开发利用价值，可作为一种新型的提取商业果胶的原材料。

目前，国内外关于豆腐柴叶的报道主要集中在营养成分、“树叶凉粉”制作和果胶提取工艺及理化性质研究等方面［6－8］，原料大多来自安徽、湖北等地，关于四川地区豆腐柴叶的研究报道很少［9－10］，且关于原料预处理对果胶特性影响的研究较浅。前期实验研究发现，不同地区豆腐柴叶果胶含量和性质存在差异［11］，“树叶凉粉”的品质与豆腐柴叶预处理和其含有的果胶密切相关。实验中常采用蒸汽、微波、酸浸泡、烫漂等方式对原料进行杀青灭酶，民间常采用烫漂方式来软化组织制作“树叶凉粉”，采用冷冻方式对原料进行贮藏。为提高原料利用率和果胶得率，探究不同预处理对豆腐柴叶果胶性质的影响，本文以四川江油地区豆腐柴叶为原料，对新鲜豆腐柴叶进行蒸汽、微波、酸浸泡、烫漂、冷冻等五种预处理，并对其果胶得率、主要成分、表面形态、结构特性进行研究，以找出一种相对较优的预处理方式，为更加全面了解四川江油豆腐柴叶果胶及相关产品的精深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐柴叶 采摘于四川绵阳江油豆腐柴基地(江油市春雨生态农业科技有限公司);半乳糖醛酸标准品(≥97%) 美国Fluka公司;咔唑、橘皮果胶标品 美国Sigma公司;盐酸、浓硫酸、无水乙醇、氢氧化钠、高锰酸钾等 分析纯。

MM823ESJ－PA美的微波炉 佛山市美的微波电器制造有限公司;SF－TDL－550台式低速大容量离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司;UV－5800PC紫外可见光分光光度计 上海元析仪器有限公司;Frontier红外吸收光谱仪 美国Perkinelmer公司;3nh色差仪 深圳市三恩驰科技有限公司;UItra55场发射扫描显微镜 德国蔡司仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 以半乳糖醛酸含量为指标，首先对各预处理进行单因素实验，结果发现各预处理最佳条件分别如下:蒸汽(1 min)、微波(400 W，2 min)、酸浸泡(用 HCl溶液调 pH至 3.0，浸泡30 min)、烫漂(85～90 ℃，2 min)、冷冻(－10 ℃，48 h)。在各预处理最佳条件下，对新鲜豆腐柴叶分别进行这五种预处理，以不处理作对照，酸浸泡和烫漂预处理后，将水沥干，置于50℃烘箱中烘干，其余预处理直接烘干，粉碎，过60目筛，室温密封储存备用。

1.2.2 豆腐柴叶果胶制备 果胶制备工艺［12－13］:新鲜豆腐柴叶经预处理后采用酸提取法［11］(料液比1∶30 g/mL，提取温度 85 ℃，提取时间 2 h，溶液p H1.6)进行提取，离心取上清液，加入等体积无水乙醇，0.1 mol/L HCl调 p H 至3.5，静置4 h，离心，弃去上清液，得沉淀。然后进行纯化:沉淀加入1/4体积无水乙醇，搅拌、静置1 h，离心得沉淀;重复一次;沉淀加入1/4体积70%乙醇，搅拌、静置1 h，离心得果胶滤饼。最后50℃热风干燥6 h、粉碎、过60目筛得果胶粉末备用。工艺过程中所有离心条件均为4000 r/min，15 min。橘皮果胶标品、未经处理、蒸汽、微波、酸浸泡、烫漂、冷冻预处理所得到的豆腐柴叶果胶粉末分别用 P0、P1、P2、P3、P4、P5、P6表示。

1.2.3 果胶相关指标测定

1.2.3.1 果胶得率 得率(%)=果胶产品质量×100/豆腐柴叶干粉质量。

1.2.3.2 果胶水分、灰分、酸不溶灰分测定 参照GB 25533－2010《食品安全国家标准 食品添加剂 果胶》进行测定。

1.2.3.3 果胶p H测定 用去离子水配制0.1%的果胶溶液，在25℃下用p H计进行测定。

1.2.3.4 果胶半乳糖醛酸含量测定 用去离子水配制0.1 mg/mL的果胶溶液，取1 mL样液参照陶阿丽等［14］的咔唑硫酸比色法进行测定。

1.2.3.5 果胶酯化度测定 参考彭小燕［15］和蒋立科等［9］的方法，并略作修改。准确称取果胶粉末0.1 g，用1 mL乙醇湿润，用去离子水溶解定容到100 mL。充分溶解后加2滴1%酚酞作指示剂，用0.1 mol/L NaOH滴定至颜色变成粉红色(pH=7.5)，30 s不变色，记录所用NaOH体积为V1;然后向溶液中加入20 mL 0.5 mol/L NaOH，在室温下搅拌静置15 min后加入20 mL 0.5 mol/L盐酸溶液，再用0.1 mol/L NaOH滴定至粉红色，30 s不变色，记录所用NaOH体积为V2。酯化度(DE)计算公式为:DE(%)=V2×100/(V1+V2)。

1.2.3.6 钙含量测定 参照GB/T 6436－2002《饲料中钙的测定》中高锰酸钾法进行测定。

1.2.3.7 色差测定 用色差仪直接测定果胶粉末色泽，以标准白板为参照。

1.2.4 扫描电镜分析 取适量干燥的果胶粉末，用双面导电胶粘附在SEM样品台上，喷金后观察果胶微观形态并使用电镜扫描拍照。加速电压为20 kV，放大倍数分别为500倍和10000倍［15］。

1.2.5 红外光谱分析 取2 mg果胶粉末，与100 mg溴化钾研磨混合后压片制样，采用红外吸收光谱仪在 400～4000 cm－1范围内进行红外光谱扫描［15］。

1.2.6 数据处理与统计分析 所有实验均重复3次，结果用珚X±SD表示。运用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0软件进行数据处理，显著性分析采用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)进行S－N－K法分析，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。Origin 8.5软件绘制图形;Photoshop CS6软件处理图像。

2 结果与讨论

2.1 不同预处理豆腐柴叶果胶主要成分分析

P0～P6主要成分测定结果如表1所示。豆腐柴叶果胶得率为8.95%～19.32%，从大到小依次为P2＞P3＞P4＞P1＞P5＞P6，P2得率极显著(p＜0.01)高于其它预处理，说明蒸汽、微波预处理能明显提高果胶得率，这是因为蒸汽和微波的热处理可以使与细胞壁结合的原果胶分离，有助于果胶的溶出;P4较P1得率仅提高0.39%，说明酸浸泡不能很好提高果胶得率，这与Olga A P等［16］的研究结果不同，可能是因为本文预处理时所用pH相对较高(本文pH=3，Olga A P等人pH=1)，对原果胶与细胞壁之间的分离没有起到很好的促进作用;P5、P6得率极显著(p＜0.01)降低，这是因为烫漂过程造成果胶流失，冷冻后的原料在低酸性环境下会发生强降解，从而影响果胶得率［16］。相较于常用商业果胶原材料橘皮、苹果渣果胶含量20%左右而言，豆腐柴叶果胶得率明显更高，这说明豆腐柴叶作为果胶提取的原材料还是具有良好的潜在开发价值。

除P1～P6酸不溶灰分指标外，其它指标均达到了国家标准。豆腐柴叶果胶半乳糖醛酸含量为69.08%～89.76%，从高到低依次为P2＞P3＞P1＞P4＞P5＞P6，P2极显著(p＜0.01)高于其它预处理，说明P2纯度最高;P6半乳糖醛酸含量极显著(p＜0.01)降低，这说明P6纯度较低，可能含有较多杂质。蒸汽、微波预处理能大幅度提高果胶得率，且所得到的果胶半乳糖醛酸含量高，所以蒸汽、微波预处理是相对较优的预处理方式。P1～P6酯化度均大于50%，属于高酯果胶，比蒋立科等［9］的研究结果略高，这可能是因为不同地区豆腐柴果胶酯化度略有不同。P1～P6灰分和酸不溶灰分含量极显著(p＜0.01)高于P0，可能是因为豆腐柴叶果胶本身含有较多的钙等矿物元素，通过对钙含量的测定也验证了其钙含量确实比P0高很多，不同预处理间钙含量的差异可能与预处理过程中钙离子与果胶分子的缔合有关，具体的机理还有待进一步研究。若要获得更纯的豆腐柴叶果胶，还需进一步进行分离纯化。

2.2 不同预处理豆腐柴叶果胶色差分析

各组果胶粉末中，P0、P2为白色粉末，P3、P5为淡黄色粉末，P1、P4、P6为浅棕色粉末，色泽和外观符合GB 25533－2010标准，不同预处理对果胶色泽有明显影响。在果胶提取分离过程中发现，果胶溶液经乙醇沉淀得到的果胶滤饼 P2、P3、P5呈白色，P1、P4、P6呈绿色，这是因为蒸汽、微波、烫漂预处理都属于热处理，能够有效使酶失活，防止酶褐变，而且在乙醇沉淀过程中色素更容易除去;酸浸泡和冷冻预处理只能在一定程度上抑制酶活性，不能有效防止氧化。最终果胶粉末的色泽还与干燥方式有关，本文采用的是热风干燥，这使得果胶滤饼在干燥过程中发生了一定程度的褐变。从得到的果胶粉末颜色来看，蒸汽是较佳的预处理方式。

为更加准确辨别不同预处理对果胶粉末色泽的影响，对P0～P6的色差进行了测定，其结果如表2所示。L*表示亮度，其值大小依次为P0＞P2＞P3＞P6＞P5＞P4＞P1，P0亮度极显著(p＜0.01)大于 P1～P6，不同预处理间，P2亮度极显著(p＜0.01)大于其它预处理亮度，表明蒸汽处理组亮度最好。a*为正值时表示红度，为负值时表示绿度，其值均为正值，说明果胶粉末有一点偏红色，其值从大到小为P5＞P6＞P1＞P4＞P2＞P3＞P0，P0红度极显著(p＜0.01)低于 P1～P6红度。b*为正值时表示黄度，为负值时表示蓝度，其值均为正值，说明果胶粉末颜色偏黄色，其值大小依次为P4＞P1＞P6＞P5＞P3＞P0＞P2，P2黄度极显著(p＜0.01)低于其它预处理黄度，表明P2黄色最浅，这与直接观测到的果胶粉末黄色深浅一致。c*表示色差饱和度，排序与b*值相同。经色差仪验证，P2色泽最佳，表明蒸汽处理下，果胶色泽最好。

表2 不同预处理豆腐柴叶果胶粉末色差分析Table 2 Color analysis of different pretreatments pectin powder from Premna microphylla Turcz leaves

2.3 不同预处理豆腐柴叶果胶扫描电镜分析

图1所示是P0～P6在扫描电镜下分别放大500倍和10000倍所观察到的形态结构。可以看出，P0和P1～P6呈现出完全不同的形态，P0在500倍时呈不规则条状、块状，在10000倍时呈网络片状、表面较光滑;P1～P6在500倍时呈块状、厚片状，在10000倍时表面形态差异明显。放大10000倍时，P1表面极其凹凸不平、无明显分层现象;P2表面光滑、有凸起;P3表面凹凸不平、出现分层、边缘出现不规则卷曲;P4表面出现大量分层且部分出现断裂现象;P5表面不平整、出现不规则分层且有裂纹出现;P6表面出现少量分层、有坑洼状、且有球状物出现。综上所述，不同预处理方式对果胶表面形态有明显影响，但具体的影响机理还有待进一步探究。除P2表面较光滑外，其它预处理果胶表面均较粗糙，这再一次说明蒸汽是较优的预处理方式。豆腐柴叶果胶呈块状或厚片状，这与彭小燕［15］、张妍楠［17］等人提取的甜菜、胡柚果胶呈现的薄片状形态不同，究其原因可能是果胶原材料来源、果胶干燥方式或提取果胶工艺的不同所致。

图1 不同预处理豆腐柴叶果胶电镜扫描图Fig.1 SEM images of different pretreatments pectin from Premna microphylla Turcz leaves

图2 不同预处理豆腐柴叶果胶红外光谱图Fig.2 IR spectroscopy of different pretreatments pectin from Premna microphylla Turcz leaves

2.4 不同预处理豆腐柴叶果胶红外光谱分析

图2中 A、B图所示是P0～P6的红外光谱图。3433 cm－1附近出现的吸收峰是O－H键的伸缩振动，峰形宽且钝，说明羟基非游离态存在，而是在分子间发生了缔合。在3000～2800 cm－1波长范围出现的较弱吸收峰是由果胶多糖甲基、亚甲基以及次甲基中C－H键的对称和反对称伸缩振动引起的［18－21］。1750 cm－1处的吸收峰为羧羰基和酯羰基中C=O键的伸缩振动，1636 cm－1处的吸收峰为游离羧基中C=O键的非对称伸缩振动，这两个特征峰证明提取物为果胶类 多 糖，也 可 用 于 果 胶 酯 化 度 的 确 定［22－24］。1444 cm－1处吸收峰是由－COOH的C－O伸缩振动引起的，证明有果胶特征基团羧基的存在;1237和832 cm－1附近的吸收峰是S=O键的伸缩振动，说明果胶含有硫酸根［25］。1400～1200 cm－1的吸收峰是由C－H键的变角振动引起的;1200～1000 cm－1的吸收峰是果胶分子中的两种C－O键的变角振动吸收，包括 C－O－H 和 C－O－C 键;1049 cm－1处有吸收峰，这是吡喃环的C－O键伸缩振动，说明果胶为吡喃环结构;920 cm－1处为D－葡萄吡喃糖的C－O－C非对称伸缩振动吸收峰;832 cm－1附近的吸收峰说明可能存在α－D－葡萄吡喃糖、α－D－半乳吡喃糖、β－D－阿拉伯吡喃糖或 α－D－甘露吡喃糖;761 cm－1附近为 α－D－木吡喃糖吸收峰。

从图2中 A、B图可以看出，P0～P6在 400～4000 cm－1范围类均表现出糖类的特征吸收峰，都含有糖醛酸羧基、羟基和硫酸基等果胶多糖主要特征吸收峰，进一步证实了所提取物质为果胶。P0～P6反映出的官能团信息一致，表明P0～P6具有相似的化学结构。但P1～P6出现峰值的位置和峰面积略有差异，如3000～2800 cm－1波长范围出现的C－H键伸缩振动，P2出现在 2974.25 cm－1、其余出现在 2929 cm－1左右，S=O键的伸缩振动P2出现在880.99 cm－1处、其余出现在832 cm－1左右，吸收峰的位移与质量效应、电子效应、空间效应等密切相关，这表明不同预处理对果胶分子的组成及空间结构有略微的影响。

3 结论

豆腐柴叶经不同预处理后，果胶得率为8.95%～19.32%，半乳糖醛酸含量为69.08%～89.76%，表明豆腐柴叶可作为一种新型的提取商业果胶的原材料。通过蒸汽预处理，果胶得率可达19.32%，且得到的果胶纯度高，说明蒸汽用于果胶提取工艺是最佳的预处理方式。烫漂、冷冻预处理后，果胶得率、半乳糖醛酸含量明显下降，表面形态粗糙，因此“树叶凉粉”的制作不建议采用烫漂预处理，冷冻储藏也不适合保存用来提取果胶的豆腐柴叶。后续研究将对豆腐柴叶果胶的一级结构、高级结构、加工特性及食用安全性作进一步分析，以期为豆腐柴叶果胶商业化及相关新产品开发提供更多理论和应用依据。