数字PCR技术及其在法医学中的应用

尚雷鹏，刘金杰，张庆霞

（1.北京市海淀区公安司法鉴定中心，北京 100192；2.北京市公安司法鉴定中心，北京 100192）

1 dPCR技术简介

1992年，SYKES等[1]使用有限稀释、PCR和泊松分布模型的方法，检测到了复杂背景下低丰度IgH重链突变基因，并对其进行了精细的定量研究。该研究提出了数字PCR的构想，与此同时阐明了dPCR检测的原则:以“终点信号的有或无”作为定量方法，这是该方法被命名为dPCR技术的主要原因[2]。1997年，KALININA等[3]使用玻璃毛细管进行了微升级的PCR反应，通过使用荧光探针收集到了基因组DNA的单分子信号，进而促进了单分子定量技术的发展。1999年，VOGELSTEIN等[4]在分析结肠癌患者粪便，并检测KRAS基因突变时，率先把样本分配到384孔板中，然后对突变基因和正常基因使用不同荧光进行检测，通过计算突变基因和正常基因的比例来得出突变率。基于该实验方法的成功，他们正式提出了dPCR概念。目前，dPCR技术已经迅速发展成为一种核酸定量分析技术和核酸定量检测技术。dPCR技术已经投入商业化生产，可以分成两大类:微滴式 dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式 dPCR （chip dPCR，cdPCR）技术。

2 dPCR技术原理

dPCR采用直接计数目标分子数而不依靠任何校准物或外标，通过计数单个分子从而实现绝对定量。dPCR将传统PCR的指数数据转换成数字信号，仅仅通过显示程序设定的循环数后扩增是否发生，即可达到核酸的绝对定量。dPCR通过“油包水”的形式将反应体系分割成一个个小微滴，然后进行PCR扩增，并对所发生的扩增反应样品进行计数[5]。dPCR在进行扩增反应前，将含有DNA模板的PCR溶液稀释后分布到大量的独立反应室，单分子间通过稀释分离，并且独自进行PCR扩增，最后分析每个扩增产物。具体而言，就是采用“分而治之”的检测策略:将起始待测模板细分为若干小份，使每1份中至多分配到1个核酸分子，在每个小份中使得单个拷贝核酸分子进行PCR反应，最后计数有扩增反应小份的数量即可确定目标模板拷贝数。这种核酸定量方法实现了对单个DNA分子的扩增反应和检测，每个模板 DNA分子的反应结果，根据有无荧光信号分别标记阳性微滴为“1”，阴性微滴为“0”，计数结果根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，进而计算出待检靶分子的浓度或拷贝数[6-7]。这实现了通过先于PCR扩增的样品分离。这种样品的分配可以消除本底信号的影响，提高低丰度靶标的扩增灵敏度，简单计算出DNA的模板拷贝数而不需要采用参考标准物或者外标。因此，dPCR技术是一种对待测核酸分子进行绝对定量的方法[8]。

3 dPCR技术的特点及其应用于法医学的可行性

与传统PCR技术相比，dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点，成为了法医学研究中的重要工具。

3.1 高灵敏度

在法医学实际案件中，常见的脱落细胞等接触类检材最为常见，通常其模板量低而不易获得。而dPCR技术通过“油包水”的形式将反应体系进行微滴分割，每个微滴独立进行PCR反应，经过40～45个循环的扩增，不仅能消除本底信号的影响，而且能提高低丰度靶标的扩增灵敏度，特别适用于痕量待测样品。传统的毛细管电泳和定量PCR的检测灵敏度约为0.1%～1%；二代测序的灵敏度可达到10%；而最新的QX200微滴式数字PCR在高丰度野生型序列构成的干扰背景中检测低频率的突变序列，灵敏度可达到0.001%～0.0001%。基于此，dPCR技术还可以实现检测大量样品中的微量待测分子的目的，在病原微生物的检测中有着广泛的应用[9-10]。

3.2 高精确度

dPCR技术在计算数万个反应单元中阳性反应单元的数量和比例时，能够精确地检测出变化微小的目的序列差异。目前对于低丰度目标序列的检测，背景DNA会干扰定量 PCR、杂交、毛细管测序及NGS等方法，使其精确度检测不够准确。而经过微滴化处理的微滴式dPCR系统可将稀有核酸序列与大量的背景DNA分开，最终提高检测的精确度及重复性。

3.3 高耐受性

在dPCR技术的第一步反应体系分配过程中，某些反应单元会一定程度地富集低丰度的目的序列。在该类反应单元中低丰度的目的序列会显著地降低背景序列和抑制物对反应的干扰；dPCR技术对每个反应单元的结果判读简单，仅需要判断阳性／阴性状态即可。因此，基于dPCR技术对背景序列和抑制物的高度耐受能力以及无需依赖Ct值，很少受扩增效率影响的特点，使得在法庭科学案件的检测当中dPCR技术较之于常规PCR技术具有很大的优势。

3.4 绝对定量

在法医学应用中，该技术的绝对定量优势体现在当应用dPCR直接计算目的序列的拷贝数时，无需依赖Ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测，其精确定量能力优于常规的RT-PCR技术。

4 dPCR技术在法医学中的实际应用

4.1 dPCR技术在下一代测序方面的应用

二代测序文库的定量是确保测序平台准确、高效的重要前提，dPCR为高通量测序提供了灵敏的和绝对的校准[11]。下一代测序（next generation sequencing,NGS）如 454，Solexa和 SOLiD平台需要通过测序校正分子数量。然而，dPCR可以精确定量454和Solexa测序文库，使其制备达到纳克级，同时在仪器滴定的成本和时间方面节省了花费。

WHITE等[12]的研究结果首次证明了使用454平台进行皮克级DNA样品测序，在无预扩增时对DNA样品的需求量降为原来的1/1000以下。dPCR技术实现了测序文库的绝对定量，消除了一些不确定因素如构建和PCR定量标准曲线等，相对标准偏差低于10%，无滴定情况下，符合直接测序的精度要求。dPCR微滴扩增产物可以方便回收，为测序文库预扩增提供了新的手段，有利于减少扩增偏好性的不利影响，增加稀有序列的覆盖度，对稀有突变和拷贝数变异具有极大的优势。

TOSHIKATSU MITSUI等[13]首次采用 NGS对甲状旁腺功能减退症病人进行了全基因组测序，测序结果发现GCM2相关的突变。在对该突变位点进行确认的时候采用了aCGH和微滴式数字PCR两种不同的平台。aCGH未能确认 NGS的结论，但是ddPCR的结果完美地支持了NGS的推论。这也是首次采用ddPCR方法验证NGS发现的亚微观水平的缺失。

4.2 dPCR技术在种属鉴定和定量方面的应用

目前常用的方法有毛细管电泳法和实时荧光定量PCR技术。但这两种检验方法对于样本DNA的含量要求拷贝数高于十个拷贝且实时荧光定量PCR技术只能进行相对定量，所得结果易受多种因素影响[14]。

微滴式dPCR技术，是将样本通过微滴发生器进行微滴化处理，制成若干微滴后进行的 PCR反应。 PCR反应结束后，由微滴检测器对每个微滴逐个检测，最终经分析软件计算出目标DNA分子的浓度（copies/μL）[15]。微滴式数字PCR 技术与传统方法相比，在低浓度样本检测中，具有更高的灵敏度和稳定性。

实时荧光定量PCR等传统方法因受到非目标DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求，而微滴式数字PCR通过微滴化处理，使得目标片段从大量的非目标DNA或杂质中分离出来，在单个微滴中独立地进行PCR反应，从而提高了检测的灵敏度[16-17]。当模板DNA浓度低到个位数拷贝每微升的时候，检测结果会出现一定的偏差，这和模板DNA稀释过程中的误差、样本加入时的取样误差相关。

4.3 dPCR技术在病原微生物的检测的应用

2016年5 月，美国奥巴马政府宣布美国国家微生物组计划启动，微生物组学研究成为热点。dPCR技术高通量扩增和分析的优点使同时研究自然界的多个细菌单细胞的多个不同基因得以实现。利用dPCR灵敏度高的特点，可以对各种样品中的病原微生物展开广泛的研究，还有可能在宏基因组学的研究中对低丰度、特定种属的微生物进行检测，弥补NGS的不足。如HIV抗逆转录病毒治疗过程中病毒残留量的监控；HBV耐药突变的检测；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的院内感染监控；环境微生物不同功能基因之间的连锁分析等等。dPCR技术无需核酸标准品和标准曲线即可实现对病原微生物的绝对定量，有利于不同环境检测机构间的数据比较和分析，为危害公共卫生安全的疾病的防控提供量化标准和参考。

另外，dPCR技术对 PCR抑制物不敏感，能克服环境样本（如污水、污泥、土壤等）中大量含有的抑制物的影响，高灵敏的检出可能存在的病原微生物，实现超早期准确预警。NEJC RACKI等[9]通过对梯度稀释的轮状病毒RNA和不同浓度污水处理厂废水组合样本的系统测试，以及不同地表水样本的实际检测，利用ddPCR单分子计数的定量方式，在无标准品校正情况下不仅实现了对微量病毒高灵敏的绝对定量检出，同时展示出 qPCR不可比拟的重复性及精确度，以及对废水中 PCR抑制物的耐受能力。

4.4 dPCR技术在甲基化水平分析检测的应用

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，是表观遗传学（Epigenetics）的重要组成部分。在法庭科学领域，DNA甲基化在组织体液鉴定、同卵双生子鉴定、年龄推断、性别推断和亲子鉴定等方面具有一定的应用价值，有望成为一种新的法医学遗传标记。以目前法庭科学领域的热点、难点问题同卵双生子鉴别为例，表观遗传研究显示，同卵双生子虽具有完全相同的基因组DNA，但同卵双生子个体间DNA甲基化和组蛋白乙酰化差异显著，某些CpG岛区域的甲基化程度差异甚至超过了无关个体间的差异[18]。

OLLIKAINEN等[19]研究发现，同卵双生子新生儿不同组织IGF/H19相关的4个差异甲基化区域的甲基化状态有显著差异，并认为DNA甲基化可作为同卵双生子个体甄别的有效生物学标记。然而现有的甲基化水平分析方法存在回收率不高，会造成大量 DNA的损失；转化效率不稳定，转化不彻底或转化过度；DNA的降解和处理中片段化等问题，降低了后续分析的准确度。而微滴式dPCR系统凭借其优异的灵敏度、精确度和对目标因子的绝对拷贝数定量的特性，为甲基化程度的精确分析提供了一种新的方法。

KUNIO MIYAKE等[20]对一对患有雷特氏综合症的同卵双生双胞胎进行了基因组学以及表观遗传学的研究，文章对该双胞胎姐妹（其中一个为非典型 RTT，另一个为典型RTT）采用了第一代毛细管测序，二代测序、SNP和 CNV芯片、基因组 DNA甲基化芯片、定量 PCR以及微滴式数字 PCR（QX100）各种分析方法，得出结论:是表观遗传学水平上的差异，导致了 2姐妹不同的临床表现，而非基因组水平上的差异。表观遗传学上的差异也许主要源自 X染色体失活。TODD BLEVINS[21]率先将ddPCR技术应用到植物学（拟南芥）检测领域，文章鉴定了脱乙酰化酶 6（HDA6）和甲基化转移酶MET1之间的关系。他们发现这两种酶在维持甲基化中的伙伴关系，可以解释导致沉默位点识别的表观遗传记忆永久性，并解释这两种植物特异基因沉默酶的招募基础。研究人员利用 QX100微滴式数字PCR对相关基因的表达水平进行了分析，以判断相关基因沉默发生与否。

4.5 dPCR技术的挑战与展望

尽管dPCR概念的提出至今已经有二十多年，但其应用仍处于初级阶段，其在法医学领域面临很大的挑战[22-25]。如dPCR技术并不成熟，微滴发生与制备技术的不完善，所使用的现行仪器并不能实现更多微滴的产生。另外，微滴检测的绝对定量能力方面仍需要进一步的提升。

综合dPCR技术的特点和优势，dPCR具有测量独立性与无需任何校准物的特点。因此，该技术是潜在的核酸测量基准方法，并从原理上为核酸计量提供了保证。相比其他方法，dPCR作为绝对定量方法能准确定量目标DNA和提供可靠的定量数据。dPCR技术已经在二代测序文库制备及验证、种属鉴定、病原微生物检测、甲基化分析检测、稀有突变检测及复杂样本基因表达检测等方面有着广泛的应用。dPCR技术作为一个崭新的检测技术平台，开辟了一种全新的技术思路和手段，因此在未来几年内，dPCR有望从一种小众的技术手段发展成为实验室的标准工具，其应用领域的不断拓展，必然会促进法医学的发展。