上感合剂质量标准研究*

施 敏，管 敏

（南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

上感合剂是我院针对上呼吸道感染、发热研制的医院制剂，由羌活、薄荷、柴胡、黄芩、青蒿、生石膏、大青叶、鸭跖草、甘草9味药材组方，具有清热透表的功效。处方以黄芩和柴胡为君药，清解邪热；薄荷、羌活、青蒿、生石膏同为臣药，解肌除烦，利咽止痛；大青叶、鸭跖草为佐药，清热解毒泻火。全方共奏卫气同治、清热透表之功效［1］。是我院奚肇庆教授的经验方，临床应用30多年，疗效确切。上感合剂扩大了其中医中药的适应证，使用方便，退热作用迅速而持久，适用于内科、儿科的临床急诊和危重症。本研究中采用薄层色谱（TLC）法对该制剂中的羌活、大青叶、甘草3味药材进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱法对该制剂中君药黄芩中的主要成分黄芩苷进行含量测定，建立上感合剂的定性、定量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型安捷伦高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；AX2247H／E OHAUS型电子天平（千分之一，常州奥豪斯仪器有限公司）；BP211D型赛多利斯天平（万分之一，德国赛多利斯科学仪器有限公司）；薄层层析硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂，批号为20160712；烟台江友硅胶开发有限公司，批号为20160503）。

1.2 试药

羌活（批号为 160901），黄芩（批号为 160401），大青叶（批号为 150301），甘草（批号为 161101），薄荷（批号为 160601），柴 胡 （批号 为 161001），青 蒿 （批 号为161201），生石膏（批号为 161201），鸭跖草（批号为160401），均购自安徽省万生中药饮片有限公司；靛玉红对照品（批号为0717-200003），黄芩苷对照品（批号为110781-201213），甘草对照药材（批号为 120904-201318），羌活对照药材（批号为 120935-201413），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱级），水为超纯水，其他试剂均为分析纯；上感合剂（江苏省中医院制剂部，批号分别为 170701，170702，170703）。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

羌活：依据2015年版《中国药典（一部）》羌活项下鉴别方法［2］进行适当改进。取上感合剂（批号为170701）20 mL（相当于羌活药材1 g），蒸干，残渣加甲醇10 mL，超声处理30 min，过滤，得上清液，浓缩至5 mL，作为供试品溶液；另取羌活对照药材1 g，同供试品溶液制备方法制备对照药材溶液；取不含羌活的阴性对照溶液20 mL，同法制备阴性对照品溶液。硅胶G薄层板喷适量3% 醋酸钠溶液，105℃活化1 h，照薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5 μL，点于含醋酸钠的薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液显色，105℃加热3～5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与羌活对照药材溶液色谱相应位置上，显相同的蓝色荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图1。

图1 羌活的薄层色谱图

大青叶：取上感合剂（批号为170701）10 mL（约相当于大青叶药材0.5 g），加三氯甲烷20 mL，水浴加热回流1 h，放冷使分层，取三氯甲烷层，浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成质量浓度为1 g／L的溶液，作为对照品溶液；取不含大青叶的阴性对照溶液10 mL，依法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5 μL，点于硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，5 min内尽快观察。供试品溶液色谱中，在与靛玉红溶液色谱相应位置上，显相同的浅紫红色斑点，阴性对照无干扰，详见图2。

图2 大青叶的薄层色谱图

甘草：取上感合剂（批号为170701）25 mL（相当于甘草药材1 g），用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解，作为供试品溶液。取甘草对照药材1 g，加甲醇30 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 mL使溶解，而后同供试品溶液制备方法制备甘草对照药材溶液。另取不含甘草的阴性溶液25 mL，同法制备甘草阴性对照品溶液。硅胶G薄层板喷适量1%氢氧化钠溶液，105℃活化1 h，照薄层色谱法，分别吸取上述3种溶液各5 μL，点于含氢氧化钠的薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5 min，紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与甘草对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，详见图3。

图3 甘草的薄层色谱图

2.2 黄芩苷含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -0.2%磷酸溶液（47 ∶53）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：280 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃。

2.2.2 溶液制备

取黄芩苷对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含黄芩苷123.0 μg的对照品溶液。精密吸取样品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声15 min，放冷，补足减失的甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，滤过，制得供试品溶液。取缺黄芩的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制备缺黄芩的阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：按拟订色谱条件，测定黄芩苷对照品溶液、供试品溶液和缺黄芩阴性对照品溶液的色谱图，结果见图4。可见，黄芩苷的色谱峰理论板数、分离度、拖尾因子均符合要求，阴性对照无干扰。

线性关系考察：取黄芩苷对照品溶液，依次稀释2，4，8，16，32 倍。精密吸取上述对照品溶液，各进样10 μL。以黄芩苷的质量浓度（X）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得黄芩苷的回归方程Y＝25.65X-14.823（r2＝0.999 9），线 性 范 围 为3.85 ～ 123.00 μg ／mL。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次，记录黄芩苷对照品峰面积。结果的RSD为0.10%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：平行量取同一批（批号为170701）样品，共6份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果的RSD为1.98%（n＝6），表明方法重复性良好。

图4 高效液相色谱图

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12，24 h时进样，测定，计算峰面积。结果的RSD为1.28%（＜5%，n＝7），表明供试品溶液在 24 h内稳定。

加样回收试验：精密量取已知质量浓度的供试品溶液6份，每份1 mL，置100 mL容量瓶中，分别精密加入一定量的对照品溶液，超声15 min，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，过 0.45 μm 滤膜，滤过，进样测定。结果见表1。

表1 黄芩苷加样回收试验结果（n＝6）

2.2.4 样品含量测定

分别取不同样品3批，依法制备供试品溶液，每批取3份，依法进样测定，结果批号为170701，170702，170703的样品中，每瓶黄芩苷含量分别为753.38，750.27，759.42 mg，RSD为 0.97% （n＝3）。

3 讨论

3.1 薄层鉴别法定性药材选择

羌活的薄层鉴别参考2015年版《中国药典（一部）》方法［2］，并作了适当改进，薄层板展开晾干后在紫外光灯（365 nm）下观察，发现斑点不够清晰，不易于观察，故增加10%硫酸乙醇显色，烘烤后，斑点更清晰。以羌活对照药材为对照，增强了定性鉴别的准确性与可靠性，能较好地控制上感合剂的质量。大青叶的薄层鉴别参考2015年版《中国药典（一部）》方法，对照品靛玉红显色清晰，有明显鉴别点，因靛玉红空气中不稳定，易分解［3］，靛玉红紫红色斑点会逐渐变淡，取出晾干后应尽快观察拍照。甘草的薄层鉴别参考2015年版《中国药典（一部）》方法［2］，尝试以甘草酸铵为对照，但甘草酸铵显色需加热较长时间，点样量小显色不明显，量大容易拖尾，使用甘草对照药材后，斑点清晰，且定性鉴别的成分信息更加丰富。

方中其他药材薄荷、柴胡、青蒿、鸭跖草薄层鉴别采用药典方法［2］和文献［4-6］中的相关方法均不能得到理想结果。薄荷的鉴别中，供试品溶液中无与薄荷对照药材溶液相对应的斑点，可能是薄荷在方中含量较少，且在煎煮和浓缩过程中挥发性成分有所损失。柴胡的鉴别方法学考察时，阴性对照有干扰，调整展开剂比例后，干扰仍存在，可能是方中有极性相近成分。青蒿和鸭跖草的鉴别中，供试品溶液中鉴别点没有或不清晰。故上述4味中药的定性鉴别未列入质量标准。

3.2 高效液相色谱法定量指标选择

黄芩是该方君药，现代药理学研究表明，黄芩苷具有抗病毒、抗菌消炎等多重作用［6］，与该方的治疗目的相一致，故以黄芩苷作为上感合剂含量测定指标，参考2015年版《中国药典（一部）》黄芩项下的含量测定方法，对供试品溶液超声时间进行考察，分别超声15，30，45 min，结果黄芩苷含量无明显差异，故确定供试品溶液制备方法为“样品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声15 min”。

3.3 不足

中药制剂一般含药味较多，成分复杂。因此，薄层鉴别中仅以化学物质作为对照难以鉴别各味药材，特别是对照品为其非专属性成分时，更加难以判断所显示的斑点是否源于该药材，故在本研究中采用对照药材作参照，可供鉴别的信息更丰富，提高鉴别结果的可靠性。现行制剂质量标准制订模式中，含量测定指标的选择多考虑主要成分、易得、易测、稳定等因素［7-9］，许多制剂的指标成分与药效的发挥是否有直接关系并不确定，故并不能完全代表制剂的质量。在未来中药及中药制剂的质量标准研究过程中，必将逐渐采用“多组分”“质量标志物”等为指标综合控制中药及中药制剂的质量，体现中药的整体性和系统性。