Caspase-4 mRNA表达检测在非小细胞肺癌诊治和预后评估中的应用

彭峰， 彭奕华， 张宏华， 杨印楼

粤北人民医院呼吸内科(广东韶关 512026)

非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌常见的一种病变肿瘤，由于近年来环境的变化和人们自身的不良行为、如抽烟饮酒等导致其发病率日益上升，且病死率已跃居恶性肿瘤之首，其发病机制尚不明确且临床无明显症状，易出现误诊而使病情进入中晚期，严重影响患者的正常生活[1-2]，故如何正确地诊治NSCLC患者并做出正确治疗指导具有重要意义。有研究显示，NSCLC的发病机制与其癌细胞的凋亡生长密切相关，而半胱氨酸蛋白酶4(Caspase-4)mRNA是促进肿瘤凋亡的主要因子，能够对细胞的凋亡进行调控。但有关Caspase-4与NSCLC的关系还有待进一步深入研究[3-4]。对此，本研究通过给予NSCLC患者检测其Caspase-4表达，探讨其在NSCLC的诊治和预后评估中的应用，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年6月至2017年6月本院病理科NSCLC组织及其癌旁正常组织各100例。纳入标准：(1)经病理检查确诊为NSCLC；(2)所有患者均未接受任何抗癌治疗；(3)患者及家属签署知情同意书；(4)无沟通障碍和精神病。排除标准：(1)心、肝、肾、肾上腺等重要器官严重性疾病；(2)妊娠及哺乳特殊人群；(3)入院前1个月内有免疫、激素、抗生素等治疗史；(4)拒绝或终止本次研究者。其中男53例，女47例，年龄23～80岁，平均(52.64±14.64)岁。癌症TNM分期：Ⅱ期33例，Ⅲ期40例，Ⅳ期27例。癌症类型：鳞癌37例，腺癌63例。本次研究已经我院伦理委员会审批且通过，所有数据来源真实可靠。

1.2 方法 所有患者经临床确诊为NSCLC并且均未进行放疗、化疗，利用常规手术切除NSCLC组织及其癌旁正常组织作为新鲜标本，采用免疫组化SP法检测Caspase-4在组织中的mRNA阳性表达，所有标本经10%甲醛固定和石蜡，包埋后，连续切片进行脱蜡，切片厚度均为4 μm，同时给予3%H2O2孵育灭活内源性过氧化物酶、封闭非特异性抗原位点等预处理，加入实验鼠抗人Caspase-4作为一抗，4℃孵育过夜，漂洗、复温37℃，加生物素标记二抗工作液37℃孵育30 min，PBS缓冲液漂洗、DAB显色后用苏木素复染3 min，进行脱水待切片透明后用中性树胶封固，高倍显微镜下镜检，PBS替代一抗作阴性对照。

1.3 指标观察和标准 着色强度高于背景非特异性染色者为阳性。随机选取瘤细胞分布密集区域的10个高倍镜视野进行计数，根据SP法染色以细胞质和细胞核中出现变异性染色的深浅进行评分，阳性强度以无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。根据组织染色细胞所占总细胞数百分比评分：阳性细胞数<5%为阴性(0分)，5%～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，>75%(4分)。两者评分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)；方便试验操作和分析，用(-)代表阴性，(+)、(++)、(+++)代表阳性[5-6]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件，计数资料以(%)表示，采用2检验，Z检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织Caspase-4的阳性表达比较 NSCLC组织Caspase-4阳性表达[83%(83/100)]明显高于癌旁正常组织[0%(0/100)]，差异有统计学意义(2=135.36，P<0.001)。见图1。

图1 NSCLC组织Caspase-4阳性表达(DAB+酶底物染色，×400)

2.2 Caspase-4 阳性表达与NSCLC病理情况的关系 Caspase-4 阳性表达与组织类型、分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)；Caspase-4 阳性表达与性别、年龄、临床分期无关(P>0.05)。见表2。

表2 Caspase-4 阳性表达与NSCLC病理情况的关系例(%)

2.3 Caspase-4不同表达的患者生存预后比较 Caspase-4 表达阳性患者1年无进展生存率为60.00%(60/100)，明显低于Caspase-4 表达阴性患者的86.00%(86/100)，差异有统计学意义(2=8.621，P<0.05)。见图2。

3 讨论

NSCLC是临床上常见的一种恶性肺癌，其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚，加之该病情无明显表现，故多数患者发现时已处于中晚期，随着近年来环境的变化和不良习惯导致NSCLC发病率逐渐上升，严重影响患者的健康生活和生命安全，故如何对NSCLC患者进行正确的诊治及预后的分析具有重要的临床意义[7-8]。

有研究显示，NSCLC的发病机制与其肿瘤细胞的生存及凋亡有关，肿瘤细胞得以生存，患者的病情愈发严重[9-11]。而Caspase家族未活化时以酶原形式存在，成为活性酶时就是将其原结构域切除，在死亡受体诱导的细胞凋亡中发挥主要作用，同时也是细胞凋亡的控制中心，其中Caspase-3活化是导致细胞凋亡的中心枢纽[12-14]。但随着近年来医学研究及技术的提高，Caspase-4作为一种突变蛋白已成为NSCLC的研究热点，其机制可能通过抑制Fas介导的Caspase-3活化，从而导致细胞凋亡的抑制而发生癌变，但Caspase-4与NSCLC的因素分析还有待深入研究[15-16]。

对此，本研究通过免疫组织化学法检测Caspase-4在组织中的mRNA阳性表达，结果发现NSCLC组织Caspase-4 mRNA阳性表达明显高于癌旁正常组织，而Kim等[17]、李舒等[18]的研究中也提示NSCLC的发展与Caspase-4表达有关，进一步提示NSCLC的发生、发展与Caspase-4表达密切相关。这可能由于Caspase-4参与肺细胞凋亡过程的调节，随着NSCLC病情的发展，癌细胞会破坏肺部正常细胞的凋亡机制，肿瘤细胞的快速增长，从而激活Caspase-3抑制肿瘤细胞凋亡，继而使Caspase-4呈现高度表达[19-20]。同时本研究通过对Caspase-4相关因素分析，结果发现Caspase-4 阳性表达与性别、年龄、临床分期无关，这可能由于性别、年龄、临床分期与肺部细胞的凋亡无直接关系，但Caspase-4阳性表达与组织类型、分化程度、淋巴结转移有关，王传艳等[21]、姬斌等[22]的研究提示Caspase家族与癌组织的分化程度、淋巴结转移协同变化有关，为上述结论提供了重要的依据。这有可能由于鳞癌是发生在鳞状上皮细胞，腺癌是发生在腺上皮细胞，故后者的细胞增殖较前者强，从而使腺癌细胞中抑制Caspase-4特异性活化，降低细胞内凋亡信号，从而使细胞正常凋亡受阻。而分化程度代表肿瘤的恶性程度，其分化程度越低则意味着肿瘤细胞与正常组织相差较大，表明肿瘤细胞的增殖较为严重，进一步提示肺部细胞生存环境的凋亡机制紊乱，从而引起Caspase-4的异常表达。同时患者发生淋巴结转移则意味着肿瘤的发展可能进入晚期，肿瘤细胞通过血管侵入淋巴管，促使淋巴细胞增殖、分化，其机制可能是机体无法使肿瘤细胞正常凋亡而发生侵袭，从而进一步提出设想，这可能是Caspase-4能够有效地切割其原结构域，从而破坏了Caspase-4赖以生存的内质网稳态环境，抑制肿瘤细胞的凋亡[23-24]。此外，Caspase-4表达阳性患者1年无进展生存率为60.00%，明显低于Caspase-4 表达阴性患者的86.00%，表明Caspase-4的表达可作为NSCLC患者的预后生存指标，这有可能由于Caspase-4高度表达会破坏细胞凋亡过程，加剧肿瘤细胞的增殖与分化，继而使肿瘤发生转移，而刘小敏等[25]的研究结论也明确Caspase家族是癌细胞的预后重要因素之一，进一步提示医师应对可疑NSCLC患者进行Caspase-4 表达检测，把控患者的病情发展，同时给予患者可对抗Caspase-4高度表达的药物，提高患者的预后生存。

本研究仍存在一定不足，如样本量较少不足以代表所有案例，但Caspase-4在NSCLC组织中的mRNA阳性表达与组织类型、分化程度、淋巴结转移、生存预后有关，检测其表达可能可作为NSCLC诊治和预后的重要评估指标。