一种基于18F-19F同位素交换的分子影像探针合成方法与应用研究进展

张重庆, 孙夕林, 吴丽娜,刘杨, 申宝忠

PET/CT作为分子影像技术之一，能够在活体实现对组织、细胞及分子水平的代谢和功能状态的显像；这不仅能够揭示疾病的分子事件进行疾病的早期诊断，而且在新药研发和个体化治疗疗效监测方面有着巨大的应用潜能。因此，高特异性、高亲和力探针的开发和应用成为分子影像学的重点研究内容之一。

众所周知，在PET/CT分子显像的实践中，最为关键的是基于正电子核素的放射性探针的构建。在放化探针的研发中，因18F具有理想的半衰期(109.8 min)，易于引入化合物形成稳定的化学键以及高正电子丰度(β+>97%)等优势，成为放射性药物的研究热点[1]。

目前常规的18F标记探针的标记方法，主要包括亲核取代、亲电取代、点击化学反应及通过辅基间接标记等方法[2]。研发新的标记方法，构建出性能优异的探针，对于揭示疾病的发病机制和早期筛查有重要的临床转化意义。利用放射性核素标记生物大分子时，在相对温和的反应条件下得到高放化产率(radiochemical yeild，RCY)的药物一直是一个难题。在这种情况下，几种非碳元素(如硅、铝、硼)直接结合到生物分子中作为18F放射性标记的氟化物结合位点，引起了分子影像学界放化学家的极大关注，基于同位素交换(isotope exchange,IEX)的标记方法也应运而生[3]。例如，Schirrmacher等[4]应用氟硅化合物先偶联生物分子后，利用18F-19F IEX的原理一步标记得到放射性产物。2005年Ting等[5]则开发了一种利用芳香三氟硼酸盐进行生物分子标记的方法，实现了利用氟硼化合物标记生物分子以进行分子靶向成像；随后，该团队进一步研究，基于同位素交换的原理，开发了一类新型的两性放射合成子(radiosynthon)，其典型代表是N-烷基胺甲基三氟硼酸盐(ammonimethyltrifluoroborate,AMBF3)[6]，利用该合成子及其类似物，成功标记了多种生物分子和功能片段，合成的一些探针表现出优秀的在体分布性能，本文就目前该标记方法和应用研究进展进行综述。

基于同位素交换利用AMBF3标记的方法与优势

1.利用放射性合成子AMBF3的标记方法

该标记方法主要分为三步：①放射性合成子AMBF3的合成。 AMBF3合成子可以先通过N，N-二甲基炔丙基胺与碘代甲基硼酸频哪醇酯 (iodomethylboronyl pinacolate)发生烷基化反应，得到的中间产物在与氟氢化钾在酸性溶液和45℃的条件下反应两小时经氨水淬灭得到放射性合成子AMBF3[7]。 ②生物分子与放射合成子的偶联。其主要原理是通过该合成子一端炔基结构与含有叠氮结构的目标生物分子在铜催化下的点击化学反应(copper-Catalyzed click reaction,CuAAC)合成生物偶联缀合物。非肽类的叠氮化功能分子易从商业来源获得，可以直接与放射合成子进行偶联。对肽类生物分子进行偶联前，则需先在肽的N端偶联叠氮结构。其主要步骤为：在N-甲基-2-吡咯烷酮中使用过量的溴乙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(bromoaceric acide- N-Hydroxysuccinimide easter,NHS ester)在室温下将溴乙酸NHS酯偶联至肽序列的N端；通过将肽与过量的叠氮化钠一起孵育，用叠氮化物置换由步骤1得到的连接肽的末端溴化物，分离纯化后即可进行与放射合成子偶联。③18F-19F同位素交换两步。 合成该生物分子偶联物后，通过18F-19F IEX在pH值为2.0～2.5的条件下(邻二氮杂苯-盐酸缓冲液配置)，反应20min后即可完成18F标记,然后在氨水淬灭后，通过C18 light固相萃取柱进行分离。短时间内即可获得高比活度(>3Ci/mmol)、高纯度(>98%)及较高放化产率(RCY>20%～40%，n>20)的放射性产物(图1)。

图1 利用放射性合成子AMBF3的标记流程

2.利用AMBF3进行放化标记的优势

由于氟元素特殊的化学性质，常规的18F标记多需要进行共沸干燥，然后在有机溶剂中进行反应，且反应条件较为苛刻。而上述标记策略能够实现在水性条件下进行标记，无需干燥步骤。同时，该方法分离提纯手段简单，进一步缩短了标记时间，在一定程度上间接提高了合成产率。除此之外，该标记策略所引入的化学基团分子量较小，对于生物大分子或功能片段的影响较小。总结该方法的主要优势包括：①水性条件下一步法进行放射性标记；②无须对18F-进行干燥，缩短了标记时间；③无需进行HPLC分离纯化，合成步骤简单；④基于不同类型的生物分子进行标记可完成PET活体显像，适于推广应用；⑤有同时标记多个功能片段或生物分子的潜能；⑥能获得较好的放射化学产率(RCY>25%)和高比活度(>3Ci/mmol)；⑦引入的标记基团分子量较小，对生物分子性能的影响较小[8]。

利用AMBF3标记生物分子在肿瘤分子显像中的应用

1.18F-AmBF3-MJ9靶向胃泌素肽受体显像在前列腺癌中的应用

胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)是一种G蛋白偶联家族受体，通过与配体结合活化而发挥作用，与多种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌等的发生、增殖、血管形成和侵袭密切相关。蛙皮素(Bombesin，BBN)是从一种两栖动物中提取的多肽，与哺乳动物内源性胃泌素释放肽(gastric-releasing peptide,GRP)有相似的保守C 端，可以与胃泌素肽受体特异性结合。因此，研究人员利用多种正电子核素如64Cu、68Ga、18F对蛙皮素及其类似物进行标记，以实现对胃泌素释放肽受体这一靶点进行成像，从而对早期前列腺癌的诊断提供帮助[9]。

最近的研究发现，一些多肽类蛙皮素拮抗剂如RM26等，经放射性标记后对GRPR有更高的亲和性，有助于提高探针对前列腺癌肿瘤细胞的靶向[10]。因此，基于之前报道的利用放射性合成子AMBF3标记多肽的方法，Pourghiasian等[11]标记了一种GRPR拮抗剂18F-AmBF3-MJ9 并进行前列腺癌荷瘤鼠的显像。其中AmBF3-MJ9是通过铜催化的点击反应，并通过氨基甲基-三氟硼酸盐(AmBF3)共轭炔和含叠氮结构的MJ9制备，与GRPR具有良好的结合亲和力(Ki=0.5±0.1nM)。随后通过简单的一步法18F-19F同位素交换反应进行标记，在25min内完成标记，所得探针18F-AmBF3-MJ9基本参数为：放化产率(RCY)=(23±5)%(n = 3)，放化纯度>99%，比活度为(100±32)GBq/mmol)。

GRPR阳性肿瘤细胞PC3荷瘤鼠离体分布实验证明，探针在肿瘤、胰腺、小肠有高摄取，在注射探针两小时后摄取值(每克组织注射剂量百分比)分别为2.20±0.13、 4.75±2.36和8.67±11.5(%ID/g)。肿瘤与肌肉的摄取比值随时间延长明显增加，在注射探针后2h肿瘤与肌肉的摄取比值可达77±7。此外，使用GRPR拮抗剂进行阻断后显像，肿瘤的摄取可以阻断60%；同样说明了该探针能与GRPR特异性结合。在体成像和生物分布实验得出一致的结果。通过该标记方法，成功实现了GRPR受体靶向探针的一步法放射性标记，获得较高放化产率和放化纯度的探针，其肿瘤与本底的高摄取比，也为实现靶向GRPR显像提供了可能(图2a、2b)。

2. 18F-AMBF3-TATE靶向生长抑素受体显像在神经内分泌肿瘤中的应用

生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)是一种G蛋白偶联家族受体，具有典型的7-跨膜结构域。已被发现的五种不同的亚型中(SSTR 1～5)，SSTR2对生长抑素(SST)及其类似物亲和力最高。而大多数神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumors,NETs)具有高表达水平的SSTR，这为实现神经内分泌肿瘤分子显像提供了理论基础。

图2 利用同位素交换合成探针18F-AmBF3-MJ9和18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像图[11,15]。灰度值以ID%/g为准；a～b) 注射剂量百分比范围为0～3 ID%/g； c～d) 为0～15 ID%/g。T：肿瘤；I：小肠；K：肾脏。a) 18F-AmBF3-MJ9靶向前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； b) 100 ug of BAY86-7548阻断后18F-AmBF3-MJ9前列腺癌PC3荷瘤鼠成像； c)18F-AMBF3-TATE 靶向生长抑素受体阳性AR42J细胞荷瘤鼠成像；d) 阻断SSTR2后，18F-AMBF3-TATE荷瘤鼠成像。

近30年来，放化学家已经开发了许多靶向SSTR2的分子影像探针，以用于NETs的诊断、分期，甚至标记治疗性核素以完成分子靶向治疗[12]。在这些针对靶向SSTR2受体的生物分子中，特别是标记奥曲肽(Octreotate)及其衍生物(Tyr3-Octreotate,TOC、Tyr3-Thr8-Octreotate,TATE)的多种探针，已经用于靶向神经内分泌肿瘤SSTR2的无创成像。如111In-pentetreotide(商品名Octreoscan,Mallinckrodt公司)已被美国食品药品监督管理局批准用于临床，目前已成为神经内分泌肿瘤的临床诊断标准之一[13]；而68Ga标记奥曲肽的衍生物的探针如68Ga-DOTATOC、68Ga-DOTATATE和68Ga-DOTANOC等，同样显示了对神经内分泌肿瘤的高亲和性和巨大潜能[14]。但是由于111In为单光子显像剂，68Ga标记的药品尚未批准用于临床，但18F标记奥曲肽及其衍生物仍具有重要的研究价值。

2014年，Liu等[15]利用AMBF3成功标记了奥曲肽的衍生物得到了高亲和力的探针18F-AMBF3-TATE，未经衰减矫正的放化产率(RCY)为20%～25%。体外实验显示18F-AMBF3-TATE针对于SSTR2受体比68Ga-DOTATATE有更好的亲和力[Ki分别为(0.136±0.03) nM和(0.76±0.2) nM]；与SSTR其它亚型的亲和力较低或不结合，显示其具有较好的特异性。SSTR2阳性荷瘤鼠(AR42J)注药后1h行PET显像，肿瘤组织表现为明显摄取(肿瘤每克组织百分注射剂量率)，均值为(10.26±2.1)%ID/g，最大值为(23.6±3.0)%ID/g，竞争抑制剂阻断后摄取明显减低。相反，血池和肌肉中的平均摄取分别为(0.40±0.31)%ID/g和(0.11±0.03) %ID/g。离体生物分布实验和成像结果一致，肿瘤摄取百分比可达(10.11±1.67)%ID/g。动物显像和离体实验都显示该探针主要经肾脏代谢，而且非特异性结合清除迅速，肝胆摄取低，骨吸收未见显示，探针结构稳定。

将18F-AMBF3-TATE与现有的十多种标记奥曲肽及其衍生物的探针进行对比，发现该探针的肿瘤特异性摄取值最高。尤其是与标记相同生物分子的探针68Ga-DOTATATE相比，该探针的肿瘤特异性摄取是其5倍以上。该结果表明该合成方法对于提高多肽的亲和力方面有明显优势，应用这种标记方法可能对其他肽类示踪剂的研发具有重大研究价值。其高亲和力和靶向性，也为进入临床应用研究提供了可能(图2c、2d)。

AMBF3及其衍生物在多功能分子影像探针构建中的应用

在分子影像领域，多模态、多功能成像因其能够提供多方面的信息而备受关注。因此，荧光/PET双功能探针的优势是十分明显的，构建此探针可以通过在体和离体两种途径定量分析同一生物分子探针浓度，这不仅可以通过PET显像为术前诊断与分期、术后疗效监测提供帮助，更为离体组织病理学或荧光引导手术提供了可能。该标记策略，为成功标记荧光/PET双功能探针，多途径成像的实现提供了基础。

血管生成在肿瘤生长和转移过程起到了至关重要的作用，靶向肿瘤新生血管的诊断和治疗成为研究的热点[16]。整合素αVβ3作为细胞黏附因子家族的重要成员，通过调节内皮细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等功能，在肿瘤血管生成的过程中发挥重要作用[17]。1984年由Ruoslahti等[18]首先报道了含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的多肽RGD，其能被整合素αVβ3的α链的胞外段识别，成为靶向血管生成成像的重要生物分子。

图3 利用同位素交换合成双模态探针的示意图及应用[22]。a) 荧光、核素双标记模式图； b) Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate探针PET荷瘤鼠在体成像； c) 离体组织荧光成像。

整合素αVβ3在脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面中均有异常高表达，正常细胞表达程度低甚至不表达。基于RGD肽或其修饰后的标记物，在靶向αVβ3整合素的成像中广泛应用。随后放化学家对RGD肽进行了结构的优化，发现与线性RGD肽相比，环形结构的RGD肽(Circle RGD,cRGD)更稳定,具有更好的亲和力和特异性。 而针对cRGD,研究者又进行了二聚化、多聚化以增加亲和力，增加修饰基团以改善性能，引入双功能螯合剂(HYNIC、DOTA、DTPA等)以适应多种标记策略等多方面的尝试。

2013年，Li等[19]在基于同位素交换的原理下，利用一种放射性合成子18F芳基三氟硼酸根阴离子(18F-ArBF3-)成功标记二聚体环形RGD，从而得到探针[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3 ，并且和几种18F标记方法进行了初步比较，在放化产率方面，该方法与通过NOTA-bisRGD的一步18F-Al螯合合成18F-Al-NOTA-bisRGD的合成效率一致，放化产率(RCY)为5%～25%[20]；高于利用辅基进行18F两步法标记的放化产率(RCY=7%～12%)[21]。[c(RGDfK)]2E-18F-ArBF3在体成像和离体生物分布实验均显示出探针在高表达整合素αVβ3的荷瘤鼠(U87M)肿瘤组织中具有高特异性摄取(Tumer/Muscle>6;Tumer/Blood>9)，而骨的摄取值不到0.5%ID/g。

2014年，Liu等[22]利用该放射合成子标记的经验，在前述基础上进一步推进，开发出一种荧光/PET双功能探针Rhodamine-[cRGD]2-[18F]-Organotrifluoroborate，这对于实现多模态、多手段成像以便于疾病的早期诊断有着重要意义。该探针前体的合成包括三步：首先在季戊四醇核心的一条侧链上连接合成子AMBF3，然后在剩余三条侧链上连接炔基结构，最后通过点击化学与三条侧链上炔基发生环加成反应偶联一个有机荧光剂罗丹明和两个环状结构RGD。合成前体后，通过同位素交换的方法完成18F标记。利用标记的正电子核素进行高分辨的PET显像，显示出该探针具有较高的特异性(2.5～5.5 %ID/g)，离体生物分布实验也得到了一致结果(2.9～3.8 %ID/g)。同时标记的罗丹明荧光染料，则利用其较高的摩尔消光系数，易通过点击化学反应与生物分子发生共轭，同时具有生物相容性好、在体内稳定等优良的光学、化学、生物学特征[23]。因此，离体组织荧光现象也得到了较好的成像效果，肿瘤组织与肝肾对比有明显荧光(图3)。

此外，本标记方法已经在针对多种靶点的探针开发中进行了广泛而有益的探索。例如Lau等[24]利用该方法，将AMBF3与磺胺类衍生物偶联后进行18F标记， 制备了对含碳的脱水酶-IX(CA-IX) 靶点成像的分子影像探针。Zhang等[25]利用该标记方法，将AMBF3与三苯基磷及其衍生物偶联，完成18F标记后成功进行了心肌灌注显像。Li等[26]同样利用该方法成功地将18F-ArBF3与缀合磷32P的寡核苷酸进行偶联，得到了双标记的寡核苷酸，拓宽了该方法的应用范围。

基于18F-19F同位素交换的原理，利用AMBF3及其衍生物，成功实现了对生物大分子及少数小分子有机物的放化标记，同时也为多功能分子影像探针的构建搭建了一个平台。而且该方法标记过程相对简便易行，用时较短，一定程度上弥补了反应效率的不足。因而基于18F-19F同位素交换并利用该合成子标记的方法得到了广泛的应用。这些探针的开发，成功实现了针对多种靶点、多功能的分子成像，部分探针更是展现出了巨大的临床应用潜能。总之，随着该方法成功标记的生物分子或功能基团的多种探针的不断开发和广泛应用，基于18F-19F同位素交换原理并利用AMBF3及其类似物进行探针标记的策略将在分子影像学中发挥更大的作用。