肢芽间充质干细胞条件性FKBP38基因敲除小鼠模型的构建

胡 乐，李禹杨，柯志勇，张 月，张武锔

1南方医科大学基础医学院，广东 广州 510515；2广东仲元中学，广东 广州 511400

骨关节炎（OA）可引起疼痛和功能性残疾，为患者带来巨大的临床和经济负担[1]。骨关节炎特征在于关节软骨的进行性退化，有研究表明，关节软骨细胞凋亡参与关节炎发病机制[2-4]。Fkbp38蛋白是FKBP蛋白家族的成员，它与其他FKBP家族成员的不同之处在于依赖于钙调蛋白的结合发挥活性[5-6]，Fkbp38通过跨膜结构域进行膜锚定，主要分布在线粒体中。它是哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）的内源性抑制剂，其响应生长因子刺激或营养物可用性而被Rheb拮抗[7]。在生理和病理条件下的细胞凋亡调节中起关键作用，通过募集抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL来抑制细胞凋亡到线粒体[8-9]。FKBP38缺陷的小鼠在出生后不久死亡，表现出神经管闭合的缺陷，其部分原因是无限制的细胞凋亡[10]。

有研究表明，南京医科大学成功构建出在肝脏组织特异性敲除Fkbp38小鼠模型[11]，研究者发现在心脏特异性敲除Fkbp38基因之后，Fkbp38在心衰时，可抑制心肌细胞凋亡[12]。但肢芽干细胞特异性敲除Fkbp38小鼠目前尚未构建。全身性Fkbp38敲除的基因缺失研究其对特定的组织器官的作用机制。因此，本研究基于cre/loxp重组酶系统，繁殖出符合实验要求的肢芽间充质干细胞特异性FKBP38基因缺陷的条件性敲除的小鼠，为研究FKBP38在骨发育及骨关节炎中作用机制提供重要动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 肢芽间充质干细胞特异表达Cre重组酶小鼠 [005584-B6.Cg-Tg（Prrx1-cre）1Cjt/J，Jackson实验室]，FKBP38flox/flox小鼠（南京医科大学赵子健教授实验室赠送）。野生型C57BL/6小鼠（南方医科大学实验动物中心）。

1.1.2 试剂 鼠尾基因组裂解液：A液（500 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaOH、pH8.0）、B液（1 mol/L Tris-HCL、pH8.8）均为南方医科大学细胞生物学实验室配制 ； DNA Marker（VAZYME ，MD104-01 ）、PCR mix（P213）（南京诺唯赞生物科技有限公司）；琼脂糖（TSJ001）、EB替代物（TSJ002）（北京擎科新业生物技术有限公司）；PCR引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成；Tris-base（V900483）、甘氨酸（V900144）（sigma）；FKBP38一抗（Thermo Scientific）；全蛋白提取试剂盒（KGP2100）、凯基生物BCA蛋白含量检测试剂盒（KGP902）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；其他常用试剂：氢氧化钠、盐酸、乙醇、EDTA等均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的饲养与繁殖 小鼠饲养在SPF级、22 ℃恒温、60%恒湿动物房，12 h光照与12 h黑暗，昼夜交替。Cre小鼠采用Cre重组酶小鼠与野生型小鼠（C57BL/6）交配繁殖；FKBP38loxp/loxp小鼠引进后与野生型小鼠（C57BL/6）交配获得杂合子后代、后续采用雌雄均为纯合子进行交配繁殖。

1.2.2 条件性间充质干细胞FKBP38基因敲除小鼠的构建流程 将Cre小鼠与FKBP38loxp/loxp交配，繁殖出Cre/FKBP38loxp/+F1代小鼠，由F1 代Cre/FKBP38loxp/+和FKBP38fl/fl交配，得到Cre/FKBP38fl/fl小鼠，同时以同窝同龄野生型小鼠作为对照组。

1.2.3 小鼠基因型鉴定 小鼠基因组DNA提取：取小鼠鼠尾，加入100 μL裂解液A液，96 ℃金属浴锅中加热60 min，再加入100 μL裂解液B液终止反应。3000 r/min，2 min离心取上清，存于-20 ℃中备用。取4 μL鼠尾DNA样品进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，于紫外发光仪中观察，根据条带大小进行结果鉴定。PCR反应体系：10 μL Mix、2 μL引物F、2 μL引物R、4 μL模板、2 μLddH2O，共20 μL。引物序列见表1。

表1 基因鉴定引物

1.3 小鼠敲除效果验证

选择4周龄KO小鼠和Cre重组酶阴性小鼠作为对照。用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，取膝关节软骨及生长板部位，提取总蛋白，进行Western blot实验。

2 结果

2.1 Prrx1-Cre、FKBP38flox/flox和Prrx1-Cre（Fkbp38flox/flox）小鼠繁殖与基因型鉴定

Prrx1-Cre小鼠和野生型小鼠（C57BL/6）交配繁殖，获得重组酶Cre表达阳性的小鼠，部分重组酶Cre小鼠基因型鉴定结果如图1；FKBP38小鼠雌性纯合子与雄性纯合子自交繁殖，鉴定flox位点，272 bp为阳性条带，217 bp为阴性对照，获得的子代小鼠基因型均为纯合子，部分子代小鼠基因型鉴定结果如图2；将基因型为Prrx1-Cre（Fkbp38flox/+）F1代小鼠与基因型为FKBP38flox/flox小鼠交配，获得F2代小鼠，其中基因型为Prrx1-Cre（Fkbp38flox/flox）即为条件性敲除小鼠（图3），同时以同窝同龄小鼠为对照鼠。

2.2 FKBP38基因敲除效果

选择4周龄F2代小鼠，提取KO小鼠和control小鼠膝关节软骨蛋白，以β-actin蛋白作为内参，进行Western blot检测。根据图4结果，KO小鼠蛋白水平低于对照小鼠，FKBP38 基因肢芽间充质干细胞特异敲除小鼠的蛋白分析所得结果表明FKBP38 基因已经在小鼠肢芽干细胞中被特异敲除。

图1 Prrx1-Cre基因鉴定结果图

图2 FKBP38基因鉴定结果图

图3 Prrx1-Cre（Fkbp38flox/flox）基因型鉴定结果图

图4 Western blot验证FKBP38基因敲除效果

3 讨论

近些年，运用Cre/loxp重组系统介导的条件性基因敲除动物模型是研究某个基因在特定组织功能的常用策略[13]。本研究小鼠基因型鉴定结果条带大小与其他文献报道一致，Fkbp38f/f纯合子为单一条带，大小为272 bp[11]。研究通过Western blot验证小鼠敲除效果，结果可见对照组Western blot结果中有微弱条带，分析因提蛋白时取材未剔除干净其余组织所致。KO组与对照组FKBP38蛋白表达量差异明显，敲除效果明显。研究者发现FKBP38细胞凋亡机制密切相关。其中，FKBP38与Bcl-2和Bcl-xL结合，将它们募集到线粒体并抑制Hela线粒体导致的细胞凋亡[5，8-9，14]。相反，在神经元SH-SY5Y细胞中，Bcl-2和Ca2+/钙调蛋白/FKBP38复合物之间的关联促进细胞凋亡[14]。近期又有研究者发现FKBP38在心肌细胞中具有抗细胞凋亡功能[12]。由此可见，FKBP38在细胞凋亡中的功能可能是细胞类型特异性的。因此，条件性敲除小鼠的构建可以确切地研究FKBP38在枝芽间充质干细胞充当的作用。

FKBP38为mTOR内源性抑制剂，可与mTOR直接结合并抑制其活性，Rheb受生长因子及营养等条件的刺激，可作用于FKBP38，阻止其与mTOR的结合，从激活mTOR[7]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）为真核细胞生长增殖的中心调控分子，许多退行性疾病与mTOR信号通路调控有关[15]。治疗骨关节炎的临床手段有限，尚无能够治疗骨关节炎的特效药物[16-18]。因此，本动物模型的构建为寻找治疗骨关节炎的潜在靶点提供动物模型。

综上所述，本研究成功构建并验证了枝芽间充质干细胞特异性FKBP38基因敲除小鼠，为进一步研究FKBP38在骨发育和骨退行性疾病的作用，提供了一个重要的在体模型。