3D生物打印支架的微孔结构与孔隙率的研究进展

田银平，刘湘宁，2，姚 洁，谭俊龙，叶辉生

1暨南大学口腔医学院，2暨南大学附属第一医院，广东 广州 510630

由于创伤性损伤或疾病，患者对组织器官替代、修复和再生的需求不断增长，而供体器官来源有限和捐赠组织的免疫排斥，以致供不应求。这就促进了组织工程和再生医学的研究，尤其是设计一种促进各种组织再生的生物支架已成为一研究热点。

控制生物支架设计的因素很多，例如孔的几何形状、孔径、孔隙率、机械刚度和表面性质[1]。有研究报道支架孔的几何形状、孔隙率及孔径直接影响细胞的行为[2]。多种方法已被用于生产多孔的支架，包括粒子浸出、气体发泡、冷冻干燥、热诱导相分离和静电纺丝. 尽管这些常规生产的支架已被用于工程化各种组织，并取得了不同的成功，但用这些传统方法很难准确控制支架孔的几何形状，孔径和孔隙率。目前一项新兴的3维（3D）生物打印技术可以弥补传统制造方法的不足，它是一种快速成型、增材制造方法，利用生物材料或细胞以逐层方式打印出精准、仿生和个性化的支架结构，并可以随意设计支架的形状、尺寸、孔的结构和孔隙率等。近年来，3D生物打印蓬勃发展并在组织工程和再生医学研究中取得了一定的成绩。但是，研究者们仍在不断探索最适打印材料和优化打印形式、及支架的最佳孔径、几何形状、孔隙率，以求达到最理想的生物制造效果。本文将综述无生命的和有生命的3D生物打印支架材料和打印方式，以及重点介绍支架的微孔结构及孔隙率相关研究。

1 无生命的3D打印支架的微孔结构与孔隙率研究

1.1 无生命的生物材料打印方式

目前用于无生命的生物材料3D打印方式主要包括熔融沉积成形（FDM）、选择性激光烧结（SLS）和光固化立体印刷（SLA）[3]。FDA（图1A）是采用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、逐层沉积，并凝固成型，最后除去支撑材料，得到所需的三维结构；SLS（图1B）是采用激光束按照计算机指定路径扫描，使工作台上的粉末原料熔融、粘结固化，当一层扫描完毕，移动工作台，使固化层表面铺上新的粉末原料，经过逐层扫描粘结，获得三维结构；SLA（图1C）是在树脂槽中盛满液态光敏树脂，使其在激光束或紫外线光点的照射下快速固化。

图1 无生命生物材料的3种主要的3D打印技术示意图

1.2 无生命的生物材料打印支架

1.2.1 支架材料 无生命的生物材料主要包括3大类：金属、陶瓷、高分子聚合物材料。（1）金属材料具有机械性能好、强度高的特点。生物医学应用领域常用的金属材料有钛、钛合金、钴铬合金和不锈钢等；（2）陶瓷材料硬度高，耐高温，耐腐蚀等，但韧性不高，硬而脆，通常用在负载较小的部位，因其化学性质与骨组织很相似，常被用作矫形植入体或牙科材料，常用的医用生物陶瓷材料包括羟基磷灰石（HA）、磷酸钙（TCP）和生物活性玻璃;（3）高分子聚合物材料因其宽范围的物理化学性质而被广泛用于生物医学领域，如聚己内酯（PCL）、聚乳酸（PLA）、聚富马酸二羟丙酯（PPF）、泊洛沙姆以及蛋白质等天然高分子材料[4]。

1.2.2 支架微孔结构与孔隙率 基于不同的无生命生物材料，其打印的支架后期可分为直接植入和细胞接种其上共同培养后植入组织缺损处。支架植入体内起着结构支撑和细胞粘附、增殖及分化等作用，所以支架应具有足够的机械强度和合适的内部结构，因此，支架的设计必须具有多孔结构和合适的孔隙率以获得期望的机械功能和质量（水分、无机盐、营养物质和排泄物等）的流通。Zein等[5]利用3D打印技术制备了多孔聚己内酯支架，并通过改变支架微孔几何形状，包括正方形（0°/90°）（图2A）和菱形（0°/60°/120°）（图2B），寻求理想的孔隙率，从而提高支架的机械强度。Aliabouza等[6]采用3D打印技术打印不同几何形状的多孔聚乙二醇-二丙烯酸酯（PEG-DA）支架并将人骨髓间充质干细胞（HMSCs）接种其上进行培养，结果发现方形孔隙的支架在细胞生长和软骨形成方面比六边形孔隙的支架具有更好的表现。有研究[7]采用直接激光写入3D打印技术将PLA基材料制造了4种不同类型的木垛形三维支架（图3），孔径范围从25到110 μm，孔隙率70%、82%、86%和90%，将小鼠颅盖前成骨细胞接种于PLA支架上进行培养，结果发现70%孔隙率支架最初和长期不支持细胞生长。对于其它孔隙率，发现从接种后的第1 h开始，细胞的粘附力很强，并在3、8周后显着增殖。但最终研究发现，86%孔隙率支架表现出更好性能效果。Laronda等[8]优化明胶支架中孔隙几何形状，提高小鼠卵泡存活率。他们发现当卵泡与支架多面接触接触时，卵泡表现出更好的存活率。而卵泡与支架中多面接触是在于支架中的细丝具有0°/30°/60°/90°/120°或0°/60°/120°的角度时，而不是0°/90°的角度。

图2 0°/90°和0°/60°/120°微孔结构的支架形态

因此，多项研究成果指出，通过改变支架的微孔几何形状和孔隙率可以增强细胞活力和增殖。高的孔隙率和孔径有助于营养和氧气输送或使更多的细胞向内生长，但由于大量的孔隙体积，支架的机械性能将受到损害。所以在支架设计和制造期间应考虑支架的微孔结构和孔隙率使支架的机械性能和质量传输之间达到良好的平衡。

2 有生命的3D生物打印支架的微孔结构与孔隙率研究

有生命的生物3D打印是指在打印过程中有活细胞直接参与，即活细胞与凝胶类支架材料混合成“生物墨水”同时置于打印机的喷头中，由计算机控制含细胞液滴的沉积位置，在指定的位置逐点打印，在打印完一层的基础上继续打印另一层，层层叠加形成三维多细胞-凝胶支架构建体。所以，有生命的生物3D打印即通常所说的“细胞打印”，它是将快速成型技术和生物制造技术的有机结合，突破了传统组织工技术空间分辨率低的局限性，可精确控制细胞在支架材料中的定点分布，微观上构建具有适合细胞生存的微环境，使得组织和器官的体外再造成为可能。

图3 支架设计及支架上的细胞培养

2.1 有生命的生物材料打印

2.1.1 打印方式 有生命的生物材料打印（细胞打印）方式通常分为3种类型：挤压式生物打印、喷墨生物打印和激光辅助生物打印[9]。

（1）挤压式生物打印（图4A）：挤压式生物打印装置由流体供给系统和自动压出打印系统两部分组成。由电脑控制的沉积系统将“生物墨水”挤压、打印成形，细胞被精确地封装在三维结构中[10]。挤压式打印更有利于控制支架的孔隙结构、可打印高浓度细胞溶液且细胞密度可控，成本较低，是目前使用最为广泛的方法。但其打印精度有限，打印材料在喷嘴壁上的剪切力会减小细胞存活的数量，打印过程影响细胞活性，打印后细胞面临脱水及缺少营养问题。

（2）喷墨生物打印（图4B）：喷墨生物打印是最早应用于打印细胞的技术，它是将活细胞、培养基及水凝胶组成的混合生物墨水通过计算机控制以液滴的形式精确地打印在接收平台的凝胶基质上，随后固化[11]。使用喷墨式打印技术得到的细胞活性较高且成本较低，但无法打印黏度较高的生物墨水，细胞在培养液中的分散程度也不可控，而且效率较低。

（3）激光辅助生物打印（图4C）：激光辅助生物打印可分为两个类别，一是激光导致局部射流形成的细胞打印，二是过程涉及光聚合的成型技术[12]。激光辅助的生物打印虽然可实现高黏度生物墨水打印和高分辨率，但效率较低，激光容易损伤细胞，且该方法不利于多种细胞的混合打印。

图4 3种细胞打印技术的示意图

2.2 有生命的生物材料支架打印

2.2.1 支架材料 在细胞3D打印中的打印材料即负载细胞材料，它要求在打印的过程中及打印之后，材料中所包含的细胞必须保证在一定存活率，而且其中的生物、化学因子必须仍然有效。所以，其打印材料应具有印刷适性、良好的生物相容性和力学性能。如今水凝胶作为细胞打印的支架材料引起了研究者们的广泛关注，它是由高聚物的三维交联网络结构和介质共同组成的多元体系，其主要作用是维持三维空间结构及组成细胞外基质[13]，它的存在可以进行细胞的保护、细胞间的黏合扩展及器官的构型。因此，水凝胶成为负载细胞的首选[14]。负载细胞的水凝胶包括天然水凝胶，如琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白和透明质酸以及合成水凝胶，如泊洛沙姆和聚（乙二醇），或两者的混合[15]。

作为细胞打印支架的水凝胶在生物医学的基础和应用研究中正不断的被广泛研究。杭州电子科技大学以明胶、海藻酸钠、卵巢癌细胞制成细胞悬浊液置于3D打印机打印，得到卵巢癌三维结构模型，用于研究癌细胞转移[16]。Lee等[17]以胶原水凝胶为支架材料，脐带静脉血内皮细胞为种子材料打印出的人工血管模型可较好模仿人体内微循环、血液渗透等生命过程。细胞直接参与的3D打印生物材料仍在不断地被研究与开发，希望开发出具有适当力学性能，良好生物相容性和生物活性的生物材料，力争攻破目前3D打印组织器官有关材料存在的诸多问题，为实现3D打印真正造福人类奠定基础.

2.2.2 支架微孔结构与孔隙率 在细胞3D打印支架中，细胞被包埋并限制在纳米级尺寸的凝胶网络中，以至细胞生长和组织形成严重受到限制[18]。所以，一方面细胞3D生物打印支架要构建具有一定孔隙的结构，另一方面水凝胶本身也应具有合适的孔隙，来改善它们的渗透性和为细胞粘附、生长增殖创造空间。为了研究孔隙率、孔径和微孔几何形状对支架力学和生物学性能的影响，Domingos[19]等采用细胞生物打印技术构建具有方形、三角形和复杂内部几何形状（0°/90°，0°/60/120°和0°/45°/90°/135°）的互连孔的聚己内酯/人间充质干细胞支架，孔径245～433 μm，孔隙率49%～57%. 机械压缩试验表明，随着孔隙率和沉积角度的增加（从0°/90°到0°/45°/90°/135°），支架钢度降低。使用人间充质干细胞进行的生物分析的结果表明孔径和几何形状对细胞活力有强烈影响。打印出的三维结构其内部孔的大小和形状对细胞的增殖和迁移有重要意义，石然[4]设计了3种不同的小孔形状：三角小孔、方形小孔和六边形小孔。其中每种小孔又分为有侧向通道和无侧向通道，最后发现侧向通道既可以保证营养物质均衡分配到每一个细胞，又同时保证代谢产物不会堆积。Billiet等[20]构建了载有肝癌细胞的明胶甲基丙烯酰胺3D多孔支架，100%互连的孔网络具有高机械稳定及细胞活力（＞97%）。Luo等[21]制备海藻酸钠－明胶水溶胶，与兔原代肝细胞共混作为生物墨水，采用圆柱状微丝逐层交错堆积技术，进行兔肝细胞－海藻酸钠－明胶共混物的3D生物打印，获得内部结构为网格状，尺寸大小为10 mm×10 mm×1.2 mm，微丝间的空隙相互连通，孔隙大小为450 μm×450 μm的三维结构体。打印后的兔肝细胞在三维结构体中密度较高，分布均匀，存活率为（82±3）%，为构建类肝组织工程结构体片段奠定基础。为了探索大孔水凝胶支架中大孔结构对细胞功能的影响，Fan等[22]使用生物相容性致孔剂制备了3种模型凝胶构建体。结果发现更好的可渗透水凝胶促进细胞生长和快速增殖，以及细胞外基质（ECM）（例如胶原蛋白，糖胺聚糖）的分泌增加，大孔结构提高了凝胶支架的渗透性，促进了营养物和废物排泄在支架中的扩散，以及为软骨细胞增殖提供生存空间。You等[23]报告了一种基于生物打印的多孔细胞负载的藻酸盐凝胶构建体，并研究了细胞活力，细胞增殖和软骨ECM沉积。其多孔凝胶支架支持高细胞活力和软骨ECM的沉积，表明它们在软骨组织工程领域的应用潜力。

细胞3D生物打印支架的微孔结构和孔隙率显著影响细胞的行为和健康，所以不仅要构建具有高度多孔的支架，而且选择具有适宜孔径与孔隙率的凝胶为细胞生长，增殖和分化提供足够的空间和良好的渗透性。下表为适用于不同细胞类型活性的生物支架的孔径与孔隙率的范围概括（表1，2）。

3 结论与展望

随着科学研究的不断进步，3D生物打印的研究实现了从无生命材料到有生命物质打印的飞跃。本文介绍了从无生命到有生命的生物材料3D打印，以及其相对应的生物支架打印方式和相关支架的结构性质（如微孔结构、孔隙率、孔径、孔隙互连性）。重点综述了适宜的微孔结构和孔隙率的支架不仅有利于改善渗透性、提供合适空间及促进营养运输、废物排泄和细胞生长增殖分化，而且还确定支架的最终机械性质。

然而，两类生物材料打印都存在一定的不足。无生命生物材料打印方法相对传统，不能精准控制细胞的位置、支架的孔径和孔隙率以及构造有序贯通的网络结构。而对于活细胞直接参与的3D生物打印的难题一方面在于如何增强支架的机械强度，另一方面又在于如何提高打印后细胞的成活率，以及促进打印后细胞的生长、增殖和分化。所以3D生物打印的发展仍面临着诸多挑战。但随着科学技术的不但发展，对于两类生物材料3D打印，我们可以将其互相取长补短，优化打印方式，开发更多可打印的生物材料，特别是研发出具有最佳微孔结构、孔径和空隙率的生物支架，以达到最理想的制造效果，从而实现3D生物打印组织器官而造福人类。

表1 不同细胞类型活性所需的各种支架的孔径和孔隙率

表2 两类生物材料3D打印支架的比较