翻压接种根瘤菌的紫花苕子对植烟土壤肥力的影响

刘明，陈远学，陈强，彭丹，喻晓，杨军伟，徐开未*

(1.四川农业大学资源学院，四川 成都 611130；2.四川省烟草公司广元市公司，四川 广元 628000；3.四川省烟草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000)

化肥的使用为作物的增产做出了巨大贡献，但是同时也给环境带来了严重的危害，阻碍了农业的可持续发展。绿肥作为一种重要的有机肥料，其在减少化肥用量、提高作物产量、培肥土壤地力等方面起到了积极的作用，种植绿肥已成为目前土壤改良的重要手段[1-2]。在烟田冬季空闲茬口种植绿肥，具有充分利用光热资源和保墒的作用，还能增加土壤中有机质的含量[3]。绿肥通过发达的根系吸收深层土壤中的养分，尤其对土壤难溶性磷酸盐具有较强的溶解和吸收能力，从而能提高土壤中的速效磷含量[4]，还具有富集钾的作用[5]。土壤微生物和酶是土壤中重要的组成部分，对土壤的养分转化、有机质分解等方面起着重要作用，是衡量土壤生态环境质量的重要指标[6-7]。绿肥还田为土壤微生物提供了充足的碳源，可以促进微生物的生长繁殖，提高土壤微生物的活性[8-9]，同时增强土壤酶活性[10]。

根瘤菌与豆科作物之间的共生固氮可为豆科作物提供50%～90%的氮素营养。在大豆(Glycinemax)、花生(Arachishypogaea)、豌豆(Pisumsativum)等经济作物种植中，接种匹配高效的根瘤菌可以大幅度减少化肥使用，提高土壤肥力，达到增产目的[11-14]。根瘤菌剂也开始应用在箭筈豌豆(Viciasativa)[15]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[16-17]等豆科绿肥上，能增加绿肥鲜草产量、提高绿肥固氮能力等。豆科绿肥主要用在冬闲地，与水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、烤烟(Nicotianatabacum)等轮作，具有增加土壤养分、提高土壤生物活性等作用[2-6,18-19]。但冬闲绿肥与主要粮食作物和烤烟的轮作体系中，一般未接种根瘤菌。如果能接种高效匹配的根瘤菌剂，会取得更好的经济效益和生态效应[12]。面对国家“十三五”化肥零增长及减施增效的重大科技需求，本研究利用前期初筛的高效紫花苕子(Viciavillosa)根瘤菌，接种于四川广元烟区冬闲种植的紫花苕子，充分发挥根瘤菌的生物固氮和翻压豆科绿肥的肥土效应，在紫花苕子翻压还田种植烤烟减少20%施肥量的基础上，探究接种根瘤菌的紫花苕子翻压对植烟土壤肥力和土壤微生物群落的影响，为四川烟区更优的绿肥-烤烟轮作模式提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2015-2016年在广元市剑阁县普安镇光荣村烤烟主产区(105°42′ E、31°62′ N)进行。试验地海拔620 m，年平均气温17.3 ℃，年日照时数1443.3 h，年降水量1205.4 mm。土壤类型为紫色土，pH 6.6、容重1.3 g·cm-3、有机质26.1 g·kg-1、全氮1.1 g·kg-1、碱解氮102.7 mg·kg-1、有效磷11.5 mg·kg-1、速效钾79.0 mg·kg-1。

1.2 供试材料

供试绿肥品种为光叶紫花苕子(以下简称“苕子”)。供试烤烟品种为云烟87，由广元市烟草公司统一育苗提供。供试根瘤菌菌株为JSP2-5，该菌株为前期经过砂培试验初筛得到的高效根瘤菌。将该菌株制成根瘤菌剂，菌剂的生产和质量检测方法参照文献[20]。经检测，菌剂中根瘤菌JSP2-5活菌数含量为2.9×108CFU·g-1。

1.3 试验设计及管理

烤烟地冬闲时(2015年10月7日)种植苕子，设置3个处理，CK-不种苕子(冬闲)、V-苕子不接种根瘤菌、VR-苕子接种根瘤菌JSP2-5。小区面积36 m2(6 m×6 m)，每个处理3次重复，随机区组排列。根瘤菌剂采用拌种法，苕子的种子用量为138 kg·hm-2，菌剂用量为15 kg·hm-2。播种前利用旋耕机翻耕试验地，播种后再利用旋耕机将土壤表面的种子翻入土。在紫花苕子生长过程中，除接种根瘤菌外，不施用任何肥料。适当挖排水沟，确保能排能灌。苕子初花期时(2016年3月12日，生育期187 d)翻压回田。

苕子翻压后45 d(2016年4月26日)种植烤烟，处理与苕子种植相对应，同样设置3个处理：1)CF [对应轮作苕子季的CK-不种苕子(冬闲)]，同样用翻压苕子的方法进行了翻耕，按照广元烟草公司推荐施肥量进行，即全量施肥；2)V-20%CF(对应轮作苕子季的V)-翻压不接种根瘤菌的苕子但减少20%施肥量；3)VR-20%CF(对应轮作苕子季的VR)-翻压接种根瘤菌JSP2-5的苕子但减少20%施肥量。烤烟管理按照当地习惯进行。广元烟草公司推荐施肥量：烟草专用复合肥450 kg·hm-2(N∶P2O5∶K2O为2∶3∶5)；商品有机肥750 kg·hm-2；磷肥225 kg·hm-2；油枯300 kg·hm-2。

1.4 测定项目与方法

苕子初花期时采集苕子样品。采样方法：使用20 cm×20 cm的采样框，随机采集小区内的地上植株及耕层的根、根瘤，每个小区重复3次。测定植株株高(皮尺测定苕子地上部分高度)、鲜干草产量、根产量、总根瘤和有效瘤数。使用H2SO4-H2O2消煮法联合测定植株全氮、全磷、全钾含量[21]，并计算氮磷钾积累量，养分积累量(kg·hm-2)=干草产量×养分含量。

土壤样品采样时间为2016年4月25日(烤烟种植前)和2016年9月5日(烤烟收获后)。采集0～20 cm的耕层土样，用于测定土壤理化性状、酶活性、微生物数量。其中：pH值采用电位法测定，有机质采用重铬酸钾容量法测定，全氮采用凯氏法测定，碱解氮采用碱解扩散法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗显色分光光度法测定，速效钾采用醋酸铵提取火焰光度法测定[21]。蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定；过氧化氢酶采用高锰酸钾容量法测定；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定；脲酶采用纳氏比色法测定[22]。土壤细菌、真菌、放线菌数量采用平板菌落计数法测定[23], 所用培养基：细菌为牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、NaCl 5 g·L-1、琼脂15～20 g·L-1)；放线菌为高氏1号培养基(可溶性淀粉20 g·L-1、KNO31 g·L-1、NaCl 0.5 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1、FeSO40.01 g·L-1、琼脂20 g·L-1、重铬酸钾0.102 g·L-1)；真菌为马丁氏孟加拉红培养基(葡萄糖10 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、琼脂 20 g·L-1、孟加拉红0.011 g·L-1、链霉素 0.03 g·L-1)。

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 接种根瘤菌对苕子的影响

2.1.1接种根瘤菌对苕子生长的影响 从表1可以看出，VR(接种根瘤菌的苕子)与V(不接种根瘤菌的苕子)比较，总瘤数及有效瘤数都达显著性差异，分别增加50.7%、77.1%。VR的鲜草产量、干草产量、根产量、株高均优于V，但无显著性差异。可见，接种根瘤菌抑制了无效土著根瘤菌的定殖，能显著促进苕子的生长。

表1 接种根瘤菌对苕子生长的影响Table 1 Effects of inoculating rhizobium on V. villosa growth

注：V表示不接种根瘤菌的苕子，VR表示接种根瘤菌的苕子。同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: V means thatV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium; VR means thatV.villosawhich was inoculation of rhizobium. Different small letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 level. The same below.

2.1.2接种根瘤菌对苕子养分含量及积累量的影响 为有利于苕子腐解相对充分且不影响后茬烤烟烟苗的生长，在烟苗移栽前45 d即苕子初花期时就进行了翻压回田。翻压时苕子地上部分的养分含量及积累量如表2。VR的全氮、全磷、全钾含量及氮、磷、钾积累量均优于V，但无显著性差异。可见，接种根瘤菌不仅能够增加苕子的固氮量，同时能间接地促进植株对磷、钾的吸收，从而增加植株全氮、全磷、全钾含量，进而有效地增加植株的氮、磷、钾积累量。

表2 接种根瘤菌对苕子植株养分含量及积累量的影响Table 2 Effects of inoculating rhizobium on the nutrient content and accumulation of V. villosa

2.2 翻压接种根瘤菌的苕子对植烟土壤理化性状的影响

2.2.1种烟前的植烟土壤理化性状 翻压回田45 d后，接种根瘤菌的苕子对土壤理化性状影响较大。由表3可以看出，种烟前，VR(翻压接种根瘤菌的苕子)与V(翻压不接种根瘤菌的苕子)能降低土壤pH，其中VR相比CK(不种苕子的冬闲裸地)降低幅度稍大。V相比CK，有机质、有效磷含量均达显著性差异，分别增加24.1%、45.3%。VR相比CK，全氮、有机质、有效磷含量均达显著性差异，分别增加30.0%、30.8%、126.6%。VR相比V，有效磷增加55.9%，达显著性差异。说明苕子经过一段时间的腐解矿化，植株的养分释放到土壤中，改变了土壤养分含量，且翻压接种根瘤菌的苕子效果更明显。

2.2.2收烟后的植烟土壤理化性状 苕子翻压176 d后(收烟后)，在土壤中经过长时间的腐解，养分释放到土壤中，增加了土壤的养分含量。从表3可以看出，收烟后，V-20%CF(翻压不接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料)相比CF(全量施肥)的pH变化不大，而VR-20%CF(翻压接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料)相比CF的pH有所增加。VR-20%CF相比CF，全氮、有效磷含量均达显著性差异，分别增加27.3%、44.7%。VR-20%CF相比V-20%CF，有效磷含量增加64.1%，达显著性差异。说明在减施20%的肥料后，仅翻压苕子不仅促进烤烟的生长，还能增加土壤养分，培肥地力。但在减施20%的肥料后，翻压接种根瘤菌的苕子更有利于土壤养分的增加和培肥地力。

表3 翻压接种根瘤菌的苕子对植烟土壤理化性状的影响Table 3 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on tobacco-planting soil properties

注：CK/CF表示不种苕子的冬闲裸地与全量施肥相对应；V/V-20%CF表示翻压不接种根瘤菌的苕子与翻压不接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料相对应；VR/VR-20%CF表示翻压接种根瘤菌的苕子与翻压接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料相对应；CF表示全量施肥；V-20%CF表示翻压不接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料；VR-20%CF表示翻压接种根瘤菌的苕子但减施20%的肥料。下同。

Note: CK/CF means that theV.villosaare not planted in winter naked and full fertilization；V/V-20%CF means that overturningV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium and overturningV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium but reduced by 20% of the fertilizer；VR/VR-20%CF means that overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium and overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium but reduced by 20%; CF means that the full fertilization; V-20%CF means thatV.villosawhich was non-inoculation of rhizobium but reduced by 20% of the fertilizer；VR-20%CF means that overturningV.villosawhich was inoculation of rhizobium but reduced by 20%. The same below.

2.3 翻压接种根瘤菌的苕子对植烟土壤酶活性的影响

2.3.1种烟前植烟土壤酶活 土壤酶活性是衡量土壤肥力水平的重要指标。翻压苕子能提高土壤酶活性(表4)，种烟前，V与CK比较，蔗糖酶活性达显著性差异，增加62.0%。VR与CK比较，蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶均达显著性差异，分别增加82.5%、14.6%、37.8%。说明苕子翻压45 d后，经过腐解矿化提高了土壤酶活性，且翻压接种根瘤菌的苕子效果更明显。

表4 翻压接种根瘤菌的苕子对植烟土壤酶活性的影响Table 4 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on the enzyme activities of tobacco-planting soil

2.3.2收烟后植烟土壤酶活 由表4可以看出，VR-20%CF对收烟后的土壤酶活性影响明显。收烟后，V-20%CF与CF比较，蔗糖酶、磷酸酶、脲酶均达显著性差异，分别增加61.8%、29.8%、20.0%。VR-20%CF与CF比较，蔗糖酶、磷酸酶、脲酶均达显著性差异，分别增加67.0%、36.9%、20.3%。VR-20%CF酶活性均优于V-20%CF，但差异不显著。表明在减施20%的肥料的情况下，翻压苕子可以显著提高土壤酶活性，但是翻压接种根瘤菌的苕子对土壤酶活性的提高作用更明显。

2.4 翻压接种根瘤菌的苕子对土壤微生物数量的影响

2.4.1种烟前土壤微生物数量 种烟前(苕子翻压45 d后)，苕子腐解为微生物提供了充足的营养，促使土壤中微生物大量繁殖。从图1可以看出，V相比CK，细菌、真菌数量达显著性差异，分别增加72.6%、95.4%。VR与CK比较，细菌、放线菌、真菌均达显著性差异，分别增加103.0%、85.3%、236.9%。VR与V比较，放线菌、真菌数量达显著性差异，分别增加59.4%、72.4%。可见，翻压不接种根瘤菌的苕子能改变土壤中微生物群落结构，而翻压接种根瘤菌的苕子对微生物群落结构的改变更明显。

图1 苕子接种根瘤菌剂对土壤细菌、放线菌、真菌数量的影响Fig.1 Effects of overturning inoculation with rhizobium of V. villosa on quantity of tobacco-planting soil microorganisms 不同字母表示差异显著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference at P<0.05 level.

2.4.2收烟后土壤微生物数量 收烟后土壤中的微生物数量以翻压接种根瘤菌的苕子处理最为突出。从图1可以看出，V-20%CF与CF比较，真菌数量达显著性差异，增加81.7%。VR-20%CF与CF比较，细菌、放线菌、真菌均达显著性差异，分别增加65.1%、473.3%、426.0%。VR-20%CF与V-20%CF比较，细菌、放线菌、真菌数量达显著性差异，分别增加33.8%、492.4%、189.5%。可见，在减施20%的肥料的前提下，翻压不接种根瘤菌的苕子可以增加土壤细菌、真菌数量，但是对放线菌数量无增加的作用，而翻压接种根瘤菌剂的苕子对土壤细菌、放线菌、真菌的数量增加效果明显。

3 讨论与结论

绿肥在盛花期时生物量达到最大，最适合翻压[24]。广元3月平均温度是 8～17 ℃，苕子刚进入初花期，未能达盛花期。为了不耽误烤烟种植，在初花期(烤烟种植前45 d)时就将苕子翻压还田。豆科绿肥接种根瘤菌能有效地增加根部定殖瘤数，提高固氮量，从而促进植株生长[15-16]，本试验结果与此一致。在苕子生育期187 d(初花期)时，接种根瘤菌能显著增加苕子结瘤数，提高植株固氮效率，同时促进了植株对磷、钾的吸收。苕子翻压后腐解矿化，养分释放到土壤中，为烤烟提供了良好的生长环境。

土壤的环境条件是决定烤烟品质高低的一个重要生态因素[8,25]。孔伟等[26]研究表明，苕子翻压后前5周内氮释放86.9%以上，钾释放90.1%以上。烤烟种植前苕子已在土壤中腐解45 d，其氮、钾等养分可能已大部分释放，提高了土壤养分含量。种烟前，土壤中的养分含量都以翻压接种根瘤菌的苕子处理最高，尤其是对土壤全氮、有机质、有效磷的增加较为突出，这与其养分释放相关。在烤烟种植时减少20%施肥量，以苕子释放到土壤中的养分来补充烤烟苗期生长所需营养。收烟后，土壤中的养分含量还是以翻压接种根瘤菌的苕子处理最高，尤其是对土壤全氮、有效磷的增加效果突出。翻压接种根瘤菌的苕子处理收烟后的土壤全氮含量稍高于种烟前的土壤全氮含量，可能与后期苕子氮的释放量有关，也可能与苕子的氮积累量有关。可见，在苕子种植时接种根瘤菌，初花期就进行翻压，对土壤全氮、有机质、有效磷等养分含量影响明显，能有效地改善土壤肥力，达到培肥地力的目的。

土壤酶活性在一定程度上反映了土壤的肥力水平，对土壤肥力的演化具有重要影响[27-29]。土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶活性常被用来衡量植烟土壤酶活的强弱[7-8,10]。绿肥翻压回田后，本身能够在土壤中释放各种酶类，为微生物提供营养，促进微生物大量繁殖，使其产生大量土壤酶[8]。本研究得出，种烟前及收烟后都是以翻压接种根瘤菌的苕子的酶活性最高，其中蔗糖酶活性最突出。同一处理种烟前与收烟后的酶活性进行比较可以得出，种烟前的土壤酶活性都高于收烟后，这与苕子的腐解相关，由于苕子前期腐解需要大量的微生物作用，促进了酶活性的提高，而后期在烤烟生长过程中，需要大量的酶参与，从而导致收烟后的酶活性降低。可见，减施20%的肥料的情况下，翻压接种根瘤菌的苕子对酶活的影响效果更佳，这可能与接种的根瘤菌有关，根瘤菌的施用使得土壤中的微生物结构发生变化，从而影响了土壤酶活性的变化。

土壤微生物数量是衡量土壤活力的重要指标。微生物数量多和区系复杂的土壤，有利于烤烟健康生长[9]。翻压绿肥能增加土壤中微生物数量[8,30]，本研究与其结论相似。绿肥在腐解的过程中，需要大量的微生物参与。本研究发现，种烟前土壤中的微生物数量变化较大，仅翻压不接种根瘤菌的苕子与不种苕子的冬闲地比较，其中细菌、真菌增加都在72.6%以上，而翻压接种根瘤菌的苕子的微生物数量更为突出，这与接种根瘤菌密切相关。收烟后，翻压接种根瘤菌的苕子对土壤细菌、放线菌、真菌的数量影响显著，大大地提高了三大类群微生物的数量。翻压接种根瘤菌的苕子相比不接种根瘤菌的苕子，放线菌、真菌增量突出；相比全量施肥，细菌、放线菌、真菌增加效果显著。结果得出，同一处理种烟前的细菌、放线菌数量都高于收烟后，可能是因为在烤烟生长过程中，大量的细菌、放线菌在土壤中发生生理生化反应，为烤烟的生长提供营养物质。而翻压接种根瘤菌的苕子在减施20%的肥料处理收烟后的真菌数量还稍大于种烟前，这可能与苕子的翻压量有关。可见，减施20%的肥料的前提下，翻压接种根瘤菌的苕子，对土壤中微生物数量影响显著。