辣椒抗番茄斑萎病毒病研究进展及展望

王 昆 张宝玺 张正海 曹亚从 于海龙 王立浩

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒番茄斑萎病毒病由番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）引起。TSWV 属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病属（Orthotospovirus），是一种检疫性植物病毒，起源于澳大利亚（Brittlebank，1915；Samuel et al.，1930），随后逐渐蔓延到欧洲、非洲、北美洲和南美洲（Culbreath et al.，1991；Peters et al.，1996；Rosales et al.，2007）。近些年，在伊朗、日本、韩国和中国等亚洲中东和远东国家也发现了TSWV（Golnaraghi et al.，2001；Massumi et al.，2007；Lian et al.，2013）。TSWV 可侵染82 个科1 000 余种植物（Timmerman-Vaughan et al.，2014），20 世纪80、90 年代TSWV 在西班牙、美国、巴西、意大利等国家对番茄、莴苣、辣椒、花卉造成大面积减产甚至绝产（Cho et al.，1987；Epinosa et al.，2002）。由于对植物危害严重，TSWV 在世界十大重要植物病毒排名中已居第2 位（Scholthof et al.，2011）。我国自1984 年首次在广州发现TSWV 为害花生后，1987 年四川省首次报道了TSWV 为害番茄（苏大昆 等，1987），随后又在烟草、辣椒、马铃薯等多种作物中发现了TSWV（许泽永 等，1989；姚革，1992；丁铭 等，2004；张仲凯 等，2004）。

1 辣椒TSWV 的发生与分布

1.1 辣椒TSWV 的分布

从地理位置上来看，TSWV 的发生分布于热带、亚热带、温带等气候带（Accotto et al.，2000）。从发生季节来看，TSWV 在露地主要集中在夏季发生，在温室内呈现周年发生的趋势，每年发病率差异不大，呈上升趋势，但是增长缓慢（张仲凯 等，2004；Kwon et al.，2016）。

1.2 国外辣椒TSWV 的发生情况

1984 年，TSWV 对巴西露地栽培的甜椒造成严重的为害，受害面积达69%以上（Cupertino et al.，1984）。1990 年意大利的Liguria 地区也因蓟马的发生导致辣椒TSWV 的大暴发，与此同时，美国中西部也有TSWV 对辣椒严重为害的报道（Latin et al.，1990；Lisa et al.，1990）。随后在韩国、黑山、委内瑞拉、厄瓜多尔等国家的辣椒生产中，TSWV 也相继被发现且造成巨大的经济损失（Mun et al.，2008；Zindović et al.，2011；Pérez-Colmenares et al.，2015；Sivaprasad et al.，2017）。目前，TSWV 已对南北美洲、欧洲、亚洲等地的辣椒生产造成严重威胁。此外，在辣椒中还存在TSWV 和其他病毒混合侵染的情况（Boiteux et al.，1993；Kenyon et al.，2015）。

1.3 国内辣椒TSWV 的发生情况

21 世纪初，西花蓟马在我国蔬菜作物中大规模暴发，一些专家提出应警惕TSWV 伴随西花蓟马的发生（王立浩，2003；张友军 等，2003）。在辣椒中，TSWV 已先后在台湾、广州、重庆、天津等地区大面积发生，造成巨大的经济损失（刘勇等，2010；Zheng et al.，2010；吕要斌 等，2011；郭思瑶 等，2015；高苇 等，2016）。近些年来，中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒遗传育种课题组在北京周边辣椒生产区多次检出TSWV（未发表）。由于蓟马的大面积发生，TSWV 已经在部分地区呈现高发信号（李飞，2013；郑雪 等，2015）。

2 辣椒TSWV 的症状检测

2.1 生物学方法

辣椒发生TSWV，其顶端叶片上有坏死的褪绿环斑或黄斑，沿叶柄或顶端表皮下的维管束变为褐色坏死或顶端枯死，顶端生长受抑制，严重时节间短缩，叶片坏死，植株矮化、黄化明显。成熟果实黄化，伴有同心环或坏死条纹（Boiteux，1995；Ronde et al.，2013）。辣椒TSWV 病症的产生不仅与病毒的致病因子和寄主的抗性基因产生的防御机制的相互作用有关，环境温度、蓟马传播介体的群体大小等也会对其产生影响（Lourenção et al.，1997；Stumpf &Kennedy，2007）。

2.2 血清学方法

利用抗原与抗体的体外特异性结合可以检测病毒的原理，开发了包括酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫胶体金技术（GICT）、双抗体夹心法（DASELISA）、三抗酶联反应吸附测定法（TAS-ELISA）和组织印迹法（Tissue blot-ELISA）等多种可应用于TSWV 检测的方法。利用ELISA 法可在无症状植株的叶片和根部检测出TSWV（Soler et al.，1999）。在病害监测早期，常利用ELISA 法监测带毒介体蓟马进而提前控制病毒的传播（Bandla et al.，1994；郑宽瑜 等，2015；Huang et al.，2018）。

2.3 电子显微技术

利用电镜观察病毒的形态结构及其寄主的细胞超微结构，可对TSWV 进行检测。目前，主要通过负染色法、超薄切片法、免疫电镜来实现TSWV的电镜鉴定。利用电子显微技术观测寄主组织，确定病毒类型，在TSWV 鉴定上具有重要应用价值（张仲凯 等，2000；王健华 等，2005；郑元仙和刘雅婷，2009）。

2.4 分子生物学方法

现已开发出逆转录PCR（RT-PCR）、多重RT-PCR 技术（multiple RT-PCR）、逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）、免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）、实时荧光PCR 技术、核酸分子杂交技术、核酸序列依赖性扩增技术（NASBA）等分子生物学方法，能够实现病毒的快速检测，且重复性好。RT-PCR 技术被认为是植物病原鉴定、植株病害诊断的革命性方法，可实现植株和蓟马上TSWV 的精准检测（Boonham et al.，2002；杨英华等，2011；Serena et al.，2012；吴兴海等，2016；冯黎霞等，2017；李洁等，2017）。

3 TSWV 的传播方式

TSWV 在自然条件下主要通过蓟马进行传播，此外也可通过机械摩擦、嫁接等方式传播。

3.1 TSWV 的传播载体

研究表明，蓟马是TSWV 传播的主要媒介（Wijkamp et al.，1996）。目前有9 种蓟马可以传播TSWV，包括西花蓟马（Frankliniella occidentalis）、番茄蓟马（F.schultzei）、褐花蓟马（F.fusca）、禾花蓟马（F.tenuicornis）、台湾花蓟马（F.intonsa）、佛罗里达花蓟马（F.bispinosa）、首花蓟马（F.cephalica）、烟蓟马（Thrips tabaci）、豆蓟马（T.setosus）（Wijkamp et al.，1995；Naidu et al.，2001；Avila et al.，2006；Ohnishi et al.，2006），其中西花蓟马（F.occidentalis）是导致TSWV 在世界范围内大面积发生的主要媒介（Kirk &Terry，2003；Jones，2005；Riley et al.，2011；Rotenberg et al.，2015）。

3.2 西花蓟马的传毒特性

西花蓟马属缨翅目（Thysanoptera）蓟马科（Thripidae）花蓟马属（Frankliniella），又称苜蓿蓟马，分为卵、若虫、蛹和成虫4 个发育过程，生活史平均约为40 d，锉吸式口器，通过刮破植物表皮刺入组织内部吸食汁液为害（Whitfield et al.，2005）。只能通过若虫获毒，获取时间30 min，若虫的虫龄越小获毒能力越强（Nagata et al.，1999）。TSWV 在寄主和介体体内都有复制能力。通常，在若虫体内病毒需要经过72 h 以上的复制后才能传毒。病毒先存在于西花蓟马的中肠，然后进入唾腺，排毒时间为5 min 左右，属于持久性排毒类型（许志刚，1978）。携毒西花蓟马的传毒能力可保持22～30 d（Wijkamp et al.，1996）。

4 辣椒TSWV 的防治方法

4.1 选育抗性品种

利用小孢子、原生质体融合、分子标记辅助育种、种间杂交等技术可实现抗病资源创新和新品种选育。现已在甜椒中选育出抗性材料0516（Tsw），表现出良好的TSWV 抗性（王立浩 等，2016）。

4.2 防治传播媒介

由于蓟马对TSWV 的传毒特性，对蓟马的防治也是非常的必要。可采用物理防治（紫外反射光覆盖膜）、化学防治（吡虫啉、阿克泰等内吸性杀虫剂）等消灭越冬虫源，减少春季虫源等方法控制蓟马的为害和暴发（Momol et al.，2004；Chatzivassiliou et al.，2008）。

4.3 加强田间管理

田间杂草也是TSWV 的主要寄主植物，及时清除田间杂草、拔除发病植株等都是重要的防治方法（孔凡玉，2002）。

5 辣椒抗TSWV 育种

5.1 辣椒抗TSWV 的种质资源

由于TSWV 的株系分化能力极强，因此寻找更多的抗性资源变得越来越迫切。目前报道的辣 椒TSWV 抗病材料有PI152225、PI159236、CNPH275、PI15、C00943 和7204 等（Black et al.，1991；Boiteux &Giordano，1993；Boiteux &Ávila，1994；Hobbs et al.，1994；Nuez et al.，1994）。研究发现，Capsicum baccatumPIM26-1 对TSWV 及其Tsw-RB 突变株系有更高的抗性（Persley et al.，2006；Hoang et al.，2013；Soler et al.，2015）。由于Tsw是单显性基因遗传、TSWV 分化变异频率高、全球气候变暖等原因，辣椒不同类型TSWV 抗病资源的挖掘十分重要（Farnham &Baulcombe，2006；Massimo et al.，2016）。

5.2 TSWV 的抗性基因定位及分子标记的开发

随着生物信息学的发展及辣椒全基因组测序的完成，辣椒抗TSWV 基因定位及其分子标记的开发也取得了重要进展。Jahn 等（2000）利用BC4群体获得了1 个与抗性基因共分离的RAPD 标记Q-06270，该标记位于辣椒10 号染色体，与抗性位点遗传距离2.1 cM。Moury 等（2000）利用F2群体（PI52225×PI195301），获得了4 个与抗性基因共分离的RAPD 标记，并将标记OPAC10593 转化为CAPS 标记（SCAC568），与Tsw位点的遗传距离为0.87 cM，可用于后期TSWV 抗性分子鉴定。Kim 等（2016）利用SNP 标记将Tsw位点定位于295 kb 区间内，并获得了7 个与抗性基因Tsw紧密连锁的SNP 标记（SNP246056-1、SNP246056-2、SNP246056-3、SNP246056-4、SNP653492-1、SNP653492-2、SNP653492-3），利用转基因验证，最终将CcNBARC575作为Tsw候选基因，该基因编码CNL 型蛋白。

5.3 抗TSWV 育种的分子机制

研究表明，辣椒植株通过对TSWV 产生过敏性坏死反应（hypersensitive response，HR），来实现TSWV 抗性（Boiteux，1995）。辣椒的Tsw基因抗性分子机制与番茄中Sw-5b介导的TWSV 抗性机制不同。Tsw的抗性需要NSs 蛋白编码的无毒沉默抑制子来引发HR 反应。而番茄需要NSm编码的运动蛋白作为无毒因子参与Sw-5的相互识别来诱导HR 反 应（Ronde et al.，2013；Hallwass et al.，2014；Ocampo et al.，2016；Jiang et al.，2017）。

6 展望

在“TSWV-蓟马-寄主”模式中，基因、蛋白之间的互作以及防御机制信号通路的研究仍然不够清楚，分子生物学、生物信息学技术的发展，对在分子层面揭示TSWV 感染经济作物的机制是一个重要的契机，这也将会为防治TSWV、消除TSWV 对经济作物的危害产生巨大的贡献。

辣椒TSWV 株系分化快速。携带Tsw基因的品种推广后，在巴西很快就有抗性菌株的报道，随后在意大利、西班牙、澳大利亚等国家也有相关报道（Boiteux &Nagata，1993；Roggero et al.，2002；Thomas-Carroll &Jones，2003；Margaria et al.，2004，2007，2014；Sharman &Persley，2006；Karavina et al.，2016）。中国云南地区的辣椒中TSWV-YN18 和TSWV-YN53 株系可以免疫Tsw的抗性，发现其NSs 蛋白不能介导HR 反应（Jiang et al.，2017）。

TSWV 对国内外的辣椒生产造成重大的经济损失，最有效的应对方法就是培育抗TSWV 的辣椒品种，而TSWV 突变株系的不断产生又对当前的育种工作提出严峻的挑战，在辣椒育种中利用抗性基因Tsw，同时寻找广谱抗性基因、培育抗性持久的品种是今后育种工作的一个重要方向。