粗糙化金纳米棒SERS探针用于生物成像研究

梅荣超,殷颖超,王运庆

(1烟台大学新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心,分子药理和药物评价教育部重点实验室,烟台大学,山东 烟台 264005,2中国科学院海岸带环境过程与生态修复重点实验室,中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003)

近年来,近红外(near infrared, NIR)活体荧光成像技术在药物研究领域引起了人们的极大关注[1-2],但该技术存在空间分辨率低、多元检测能力弱等局限[3],表面增强拉曼散射(SERS)成像技术已成为其有益补充．SERS成像技术采用NIR激光照射活体动物,通过测定体内SERS探针发出的NIR散射信号,实现探针的体内示踪．SERS成像技术具有灵敏度高、多元信号识别能力强、谱峰清晰尖锐等多方面的优越性[4-5]．

SERS探针是实现活体SERS成像的重要工具,典型的SERS探针主要包括金银等贵金属纳米粒子和具有特定散射信号的有机分子(即拉曼报告分子)两部分,其中贵金属纳米颗粒的形貌对探针的灵敏度有显著影响[6-7]．二维AuNR具有横向和纵向2个表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)谱峰,且纵向SPR峰位可以通过调节纳米棒的长宽比进入到近红外区,现已被广泛用作于生物成像的SERS探针贵金属纳米颗粒基底的研究[8-9]．SERS基本理论认为,表面粗糙的纳米结构具有更强的电磁增强效应,即更好的拉曼信号增强能力,据此人们合成了金纳米星[10]、金纳米花[11]和核-卫星复合粒子[12]等表面粗糙度高、SERS效应强的纳米基底．对AuNR而言,尽管其具有近红外SPR谱峰的优点,但其表面较光滑,局域表面的电磁场较弱．如何提升其SERS增强能力,制备高灵敏NIR纳米SERS探针,是本领域关注的热点问题．

本研究通过巯基聚乙二醇修饰、金纳米颗粒原位生长等步骤,合成一种表面结合金纳米颗粒的“粗糙化”AuNR(Rough (R)-AuNR)．R-AuNR纳米粒子表面富含的纳米间隙和SERS“热点”,其SERS增强能力较AuNR显著提高．将其作为增强基底制备NIR纳米SERS探针成功应用于细胞和活体小鼠体内成像,展示了良好的光学成像应用潜力．

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

氯金酸(HAuCl4)、硝酸银(AgNO3)、抗坏血酸(L-AA)、结晶紫(CV)、硼氢化钠(NaBH4)、孔雀石绿(MG)、对硝基苯硫酚(NT)和巯基-聚乙二醇(mPEG-SH)购自国药集团化学试剂有限公司;3,3'二乙基硫醛三碳菁化碘(DTTC)、3,3'二乙基硫醛二碳菁化碘(DTDC)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;DMEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清购自赛默科技公司;实验所用的水均是经过二次纯化所得的超纯水(18.2 MΩ·cm-1)．

扫描电子显微镜(S-4800)购自日本Hitachi公司;DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪购自Thermo Fisher公司; 紫外-近红外分光光度计购自Thermo Fisher公司．

1.2 实验内容

1.2.1 AuNR的合成 根据相关文献报道[13],AuNR的合成采用种子合成法进行．

种子的合成:2 mL 0.2 mol/L CTAB中加入2 mL 0.5 mmol/L HAuCl4溶液,均匀搅拌5 min后,再加入240 μL 0.01 mol/L的冰镇NaBH4溶液,快速搅拌,等溶液由浅黄色变为棕色即停止搅拌,并于室温下放置2 h．

AuNR的合成:13 mL 23 mmol/L的HAuCl4,搅拌下加入到200 mL 0.2 mol/L CTAB中,再加入11.2 mL 4 mmol/L的AgNO3,反应5 min,再逐滴加入5 mL 0.08 mol/L L-AA,等溶液变为无色时,再加入3.6 ml上述合成的种子溶液,并在室温下反应30 min之后,停止搅拌,过夜即可．

1.2.2 基于R-AuNR的SERS探针合成 取300 μL上述合成的AuNR溶液,9 500 r/min,离心15 min,底物分散在1.0 mL的10-3mol/L的mPEG-SH中,充分涡旋后,室温下,静置过夜．将静置过夜的上述溶液9 300 r/min,离心13 min,底物分散在1.0 mL的去离子水中,取500 μL上述溶液(Abs 1.0),加入50 μL 0.1 mol/L的L-AA,在均匀搅拌下加入50 μL 1.5 mol/L的HAuCl4,即可得到R-AuNR．取100 μL的R-AuNR溶液6份,分别加入一定量的拉曼报告分子CV(10-6mol/L)、MG(10-6mol/L)、NT(10-5mol/L)、DTDC(10-6mol/L)、DTTC(10-6mol/L)、Cy7(10-6mol/L),室温下放置0.5 h后即可得到含有不同报告分子的R-AuNR的SERS探针．

1.2.3 基于AuNR SERS探针的合成 取300 μL上述合成的AuNR溶液,9 500 r/min,离心15 min,底物分散在1.0 mL的去离子水中,在9 300 r/min,离心13 min,底物分散在1.2 mL的去离子水中．取100 μL的R-AuNR溶液6份,分别加入一定量的拉曼报告分子CV(10-6mol/L)、MG(10-6mol/L)、NT(10-5mol/L)、DTDC(10-6mol/L)、DTTC(10-6mol/L)、Cy7(10-6mol/L),室温下放置0.5 h后即可得到含有不同报告分子的R-AuNR的SERS探针．

1.2.4 细胞培养与细胞成像 将SMMC7721细胞(肝癌细胞系)作为单层在37 ℃的空气/CO2(95∶5)中的增湿培养箱中生长,培养基是补充有10%胎牛血清的DMEM．待细胞贴壁后,用PBS洗涤并用胰蛋白酶消化处理,并重新悬浮在新鲜的DMEM培养基中．细胞成像时,将该稀释后的细胞悬浮液500 μL(2×104个细胞)接种在含有玻璃盖玻片的24孔板上,并培养12 h以使细胞贴壁． 然后将150 μL含有DTTC 的R-AuNR SERS探针加入到24孔板中．孵育3 h后,将盖玻片上的细胞单层用PBS重复洗涤以除去没有被细胞摄取的R-AuNR SERS探针,然后用玻璃载玻片密封该盖玻片．最后通过DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪进行拉曼信号的测量(780 nm,30 mW)．

1.2.5 小鼠成像 分别将R-AuNR和AuNR制备的SERS探针(各100 μL)注射到小白鼠(约20 g)皮下的不同位置,用DXR激光共聚焦显微拉曼光谱仪(780 nm,150 mW)分别在上述两处进行拉曼信号测定,采集未注射SERS探针的空白皮肤拉曼信号作为对照．

2 结果与讨论

R-AuNR纳米粒子和SERS探针的合成过程如图 1所示．首先将过量的mPEG-SH与AuNR充分混合,mPEG-SH将AuNR表面的配体分子CTAB置换,并通过Au-S化学键稳定地结合在AuNR表面;近一步用抗坏血酸还原氯金酸的方法,以巯基为介导在mPEG-SH上原位生长金纳米颗粒,从而得到多个金纳米颗粒结合、表面粗糙化的R-AuNR纳米粒子．最后,在R-AuNR表面吸附一定种类的拉曼报告分子,得到具有该报告分子特征散射信号的高灵敏SERS探针．

图1 R-AuNR纳米粒子和SERS探针的合成示意图Fig.1 Schematic of synthesis process of R-AuNR and SERS tags

2.1 R-AuNR的形貌考察

对R-AuNR的生长过程进行形貌和光谱性质考察．图2中的扫描电镜图(图2A)显示是AuNR母核长约38 nm,宽约11 nm,表面光滑平整．mPEG-SH修饰后,AuNR母核的电位由33 mV下降至5.1 mV,表面带正电荷的CTAB配体被mPEG-SH置换．加入氯金酸和抗坏血酸后,AuNR侧面生长了多个粒径约为5 nm的金纳米颗粒,形成R-AuNR 结构(图2B)．随着Au纳米颗粒的生长,AuNR母核与Au纳米颗粒的等离子体耦合增强[14],使得R-AuNR的纵向SPR波长由AuNR的760 nm红移至840 nm(图2D)．该红移保持了纳米材料的NIR光谱吸收的性质,为后续的NIR成像提供了前提．

mPEG-SH修饰是形成R-AuNR粗糙表面结构的关键步骤．mPEG-SH中的巯基与Au0和Au3+具有强结合能力,有助于金纳米粒子在AuNR纳米界面形成晶核和生长．为了验证mPEG-SH的介导作用,我们以未修饰mPEG-SH的AuNR为核进行对照实验,如图2C所示,在相同的还原生长条件下,得到了比较粗大的AuNR(Thick(T)-AuNR),长约40 nm,宽约17 nm,表面光滑,表明生成的金原子均匀沉积生长在AuNR核心表面,不能形成粗糙表面结构．其纵向SPR峰发生了140 nm的蓝移(图2D),与粒子的长径比减小相吻合．

图2 3种粒子的扫描电镜图和紫外-可见吸收光谱图Fig.2 SEM images and UV-vis spectra of the three nanoparticles

2.2 R-AuNR拉曼信号增强性能的考察

为了考察R-AuNR的拉曼信号增强能力,选择吸收波长在紫外光区的NT,可见光区的CV、MG、DTDC以及NIR光区的DTTC、Cy7作为代表性的拉曼报告分子,将其分别和R-AuNR粒子混合并测定信号强度．以AuNR和T-AuNR作为对照纳米材料．如图3所示,R-AuNR对上述所有的报告分子都具有较好的拉曼增强能力,增强能力约是AuNR的2～8倍、T-AuNR的2～5倍．R-AuNR优异的拉曼信号增强能力与表面粗糙度增加密切相关:(1)R-AuNR表面积增大,可以吸附和容纳的报告分子数目增多;(2)表面的金纳米颗粒之间形成“SERS热点”,使吸附其中的报告分子感受的电磁场显著增强[15-16]．

图3 R-AuNR对各种拉曼报告分子信号增强性能的考察Fig.3 The Raman enhanced performance inspection of R-AuNR on many kinds of Raman reporters

2.3 基于R-AuNR的SERS探针用于细胞成像

近一步以吸附DTTC报告分子的R-AuNR纳米颗粒作为 SERS 探针,将其与SMMC7721细胞共培养,研究探针在细胞内的分布和成像情况．图4B为SERS探针和细胞培育3 h后细胞的明场图像,图4A为没有探针培育的对照组,图4B中单个细胞中的亮黄色部分表示探针在细胞中的位置,可以发现探针可以被细胞摄取,且主要分布在细胞质中,细胞的形态仍保持圆整．近一步采集单个细胞不同位置处(a～c分别为细胞外培养基质、细胞质和细胞核所处位点)的拉曼信号．如图4C所示,拉曼信号强度和探针的分布情况有良好的吻合．细胞质中分布的SERS探针较多,因而呈现出较强的拉曼信号;细胞核附近探针较少,拉曼信号明显减弱;细胞外的培养基质中未发现探针颗粒,没有拉曼信号检出．以上结果表明,基于R-AuNR 的SERS 探针可以进入细胞并生成灵敏的信号,通过单个细胞内不同区域信号强度的分析,可以反映探针粒子的空间分布差异．

图4 R-AuNR SERS探针用于细胞成像时的明场照片与拉曼光谱图Fig.4 The bright image of cells after incubation with R-AuNR SERS tags and its Raman spectra for cells imaging

2.4 基于R-AuNR的SERS探针用于小鼠成像

构建具有活体成像能力的高灵敏NIR SERS探针是研发R-AuNR粒子的重要目标．在细胞成像基础上,进一步将DTTC吸附的R-AuNR SERS探针注射到小鼠皮下(图5A),以NIR 780 nm激光作为激发光源,考察探针信号在活体内穿透能力．同时以传统AuNR为基底的SERS探针为对照．如图5B所示,注射SERS探针的两处皮肤位置有拉曼信号,拉曼谱峰与DTTC分子特征峰相吻合(图5B插图),而空白皮肤处无明显拉曼信号,表明SERS探针的NIR拉曼信号可以透过皮肤而被检测．在相同的注射条件下,比较1 247 cm-1处探针的拉曼信号,R-AuNR SERS 探针的拉曼信号约为AuNR SERS 探针的5倍,表明其活体测定的灵敏度明显提高．

(B)皮下注射R-AuNR、AuNR SERS探针和空白皮肤处的拉曼光谱图，右上角为R-AuNR SERS探针溶液的拉曼光谱图

3 小 结

本研究提出了一种简单的AuNR表面粗糙化方法,即先用巯基-聚乙二醇修饰AuNR的表面,再通过原位生长的方法得到粗糙化的AuNR,其中巯基-聚乙二醇修饰是生成表面“热点”、形成R-AuNR结构的关键步骤．通过对多种拉曼报告分子SERS增强能力的研究,表明R-AuNR的 SERS增强性能较AuNR显著提高．近一步构建了基于R-AuNR的SERS纳米光学探针,细胞实验表明SERS 探针可以进入细胞并生成灵敏的SERS信号,小鼠实验表明SERS探针的NIR拉曼信号可以透过皮肤而被检测,并且较AuNR的灵敏度提高5倍．以上结果表明基于R-AuNR的SERS纳米光学探针在细胞与小鼠的成像实验中展示了良好的生物成像能力．该探针有望在肿瘤部位成像、肿瘤的早期诊断与生物组织成像等生物医学领域发挥一定的作用．