四倍体楸叶泡桐的诱导及鉴定

张变莉 王杨 刘荣宁 范国强

摘要：将预培养不同时间的楸叶泡桐组培苗叶片分别放置到含有不同浓度秋水仙素的液体MS+NA AO.3 mg/L+B A 140 mg/L培养基上进行了染色体加倍试验，分析了变异植株倍性。结果表明：外植体接受秋水仙素处理的时间对叶片存活率、芽诱导和四倍体诱导率的影响极显著;秋水仙素的处理浓度对叶片存活率、芽诱导率的影响极显著，但其对四倍体的诱导却为显著影响;外植体预培养时间对芽诱导率和叶片存活率的影响达到显著水平。在27个试验组合中，用30 mg/L秋水仙素处理预培养6d白花泡桐叶片48 h时，四倍体诱导率最高可达5.83%。诱导出的植株叶片大而厚，气孔密度减小，单个气孔器变大。

关键词：叶片;楸叶泡桐;秋水仙素;四倍体

中图分类号：S792. 43

文献标识码：A

之章编号：1674-9944（2019）24-0059-04

1 引言

泡桐因其生长迅速，材质优良，是造纸、建筑、家具、乐器等重要用材树种之一。其树姿优美，花色艳丽，有较强的抗大气污染能力，也是我国重要的园林绿化树种之一。然而，在泡桐生产中也出现了丛枝病频发、干低冠大等问题，严重影响了其推广应用。

植物多倍体具有植株具有生物量大，抗逆能力强等优点，这极大增强了植物的观赏特性和商业价值[1-3]。近年来，范国强等成功对白花泡桐、台湾泡桐等进行了四倍体的诱导[4-6]，创制了新的泡桐种质资源，培育了泡桐新品种。本文采用不同浓度秋水仙素对楸叶泡桐（P.catalpifolia）叶片进行培养，研究其同源四倍体的诱导技术。

2 材料与方法

2.1 材料及处理

材料具体消毒处理方法参见张变莉等[7，8]的方法。将采集于河南农业大学林业试验站的楸叶泡桐种子，先用酒精和HgCI2分别进行消毒处理，再用无菌水冲洗、晾干后放置到不含植物激素的MS培养基上，在人工气候培养箱内培养。80 d后，剪取同一株楸叶泡桐组培茁顶部的2片叶子放在其器官直接发生的培养基[9]上增殖，而后取其叶片用于诱导四倍体。

2.2 试验方法

2.2.1 试验设计

如表1，采用多因素多水平完全试验设计诱导二倍体楸叶泡桐，最终得到四倍体植株。并比较四倍体诱导率和植株生长情况，筛选出诱导四倍体的最佳组合。外槽体预培养时间、秋水仙素浓度和秋水仙素处理时间分别为，O、6、12 d，10、20、30 mg/L和24、48和72h（表1）。

2.2.2 四倍体楸叶泡桐的诱导

取上述方法培育的楸叶泡桐幼苗，将形态学上端向下数的第2～4对叶片，除去叶缘后，剪成1.O cm×1.O cm小块（外植体），分别接种于盛有40 mL的MS+NA A O.3 mg/L+B A 140 mg/L培养基[11]的100mL三角瓶中，在上述温度和光照条件下预培养O，6和12 d后，再置于秋水仙素浓度分别为10、20和30mg/L的液体培养基[9 ]中浸泡处理，最后在温度为20℃的黑暗条件下诱导处理24、48和72 h。结束后，无菌水清洗外植体3次，而后转入不含秋水仙素的上述固体培养基上，于上述温度和光照条件的培养室内进行培养。每处理共60个外植体。到40 d时，统计外植体存活数及出芽数，并计算其存活率和芽诱导率。

当诱导出的幼芽长到约2 cm时，从基部剪断放入1/2 MS培养基上诱导生根，20 d继代1次，第5次继代苗培养20 d时，观察染色体倍性[8]并用流式细胞仪确认染色体数变化的楸叶泡桐幼苗的倍性[8]，并计算同源四倍体诱导率。

2.2.3 四倍体楸叶泡桐的鉴定

（1）幼苗根尖染色體计数。将制成的二倍体和诱导变异的楸叶泡桐根尖临时压片放于尼康TS -100荧光倒置显微镜（×2 000）下，观察其染色体条数并拍照。

（2）测定叶片单细胞相对DNA含量。测定二倍体和染色体加倍的楸叶泡桐叶片的相对DNA含量参照张变莉等[8]的方法。

2.2.4 幼苗形态变化

观察上述生长40 d的第5次继代的二倍体和染色体加倍后的楸叶泡桐幼苗的叶片大小、叶色、整株生长等差异。每指标测定10个样品，最后求平均值。

二倍体和染色体加倍后的楸叶泡桐成熟叶片的气孔器大小和密度测定参见张变莉等[8]的方法。

2.2.5数据处理

参见张变莉等[8]的方法。

3 结果与分析

3.1 不同处理组合对四倍体楸叶泡桐诱导的影响

由表1和表2可知，外植体预培养时间、秋水仙素质量浓度和处理时间的不同组合处理，对楸叶泡桐外植体存活率、芽诱导率和四倍体诱导率均有一定影响，但影响程度并不相同。其中秋水仙素处理时间和其质量浓度的变化对外植体存活率、芽诱导率均产生了极显著的影响。当秋水仙素质量浓度和外植体预培养时间一定时，随着处理时间的延长，外植体存活率和芽诱导率总体上呈下降趋势，四倍体诱导率则没有一致的变化趋势，但不同处理组合间差异显著;当秋水仙素处理时间和外植体预培养时间一定时，随着秋水仙素质量浓度的增大，叶片存活率、芽诱导率和四倍体诱导率也出现上述相似的变化趋势。这表明，楸叶泡桐叶片四倍体诱导率最高的处理组合（组合17）既不是外植体存活率和芽诱导率最高的组合（组合10），也不是外植体存活率和芽诱导率最低的组合（组合18）。此外，预培养时间对外植体存活率、芽诱导率有显著影响，但对四倍体诱导率影响不显著。楸叶泡桐叶片存活率和芽诱导率在组合10（预培养6 d+秋水仙素10 mg/L+处理24 h）中，预培养时间为6d时达到最高，分别为57. 32%和24. 08%。综上所述，楸叶泡桐最高四倍体诱导率的产生是秋水仙素浓度、处理时间和外植体预培养时间共同作用的结果。因此，楸叶泡桐四倍体诱导的最佳方案是组合17（预培养6 d+秋水仙素30 mg/L+处理48 h）。

3.2 鉴定楸叶泡桐变异幼苗的倍性

3.2.1 观察变异幼苗的染色体

如图1，诱变的楸叶泡桐幼苗的根尖细胞染色体条数为2n=4x=80，但正常二倍体楸叶泡桐的则为2n-2x=40（图1）。这表明，发生诱变的楸叶泡桐幼苗细胞中的染色体数为正常二倍体的2倍。

3.2.2 测定变异幼苗叶片单细胞的DNA含量

由图2可以看出，对照的二倍体幼苗仅在相对荧光强度值为50的位置上出现1个单峰，变异的楸叶泡桐也只在接近100的位置上出现1个单峰。因此，秋水仙素处理后获得的楸叶泡桐变异幼苗均为四倍体楸叶泡桐幼苗。

3.3 幼苗形态变化

比较楸叶泡桐二倍体和四倍体幼苗的形态（表3和图3）可以发现，与二倍体幼苗相比，四倍体幼苗叶片显著变大、增厚，叶色加深，叶片长宽比减小。四倍体楸叶泡桐叶片气孔明显大于二倍体，但其叶片的气孔密度与二倍体相比明显变小。

4 讨论

植物细胞染色体加倍与染色体诱变剂种类及其处理浓度、时间等因素有关。众所周知，秋水仙素是目前植物多倍体诱导中使用最广泛效果最好的化学诱变剂之一，它是生物细胞分裂中期纺锤丝形成的抑制剂。有研究发现，在植物多倍体诱导中，不同的植物细胞对秋水仙素的敏感性不同，同一种植物材料的诱导对最适秋水仙素浓度和处理时间组合也不尽相同[10-11]。对泡桐来说，获得白花泡桐、台湾泡桐等同源四倍体最高诱导卒的最适处理组合也有不同[4-6]。本实验中，处理17是楸叶泡桐四倍体诱导率最高的组合，即预培养6d的叶片在秋水仙素质量浓度为30 mg/L的液体培养基上处理24 h。该组合不是最长处理时间和最高浓度的处理，这说明，本试验的秋水仙素处理时间和质量浓度达到极限。本试验以预培养的楸叶泡桐叶片为材料，用不同浓度的秋水仙素处理，获得的诱变幼苗大部分为四倍体且可以稳定遗传。其原因可能是用30 mg/L秋水仙素处理预培养6d的白花泡桐叶片24 h时，由于叶片薄，细胞分裂旺盛、同步性好，此时秋水仙素易抑制纺锤丝的形成，从而导致大量的细胞染色体加倍，因此变异幼苗中出现嵌合体的机率就小。

参考文献：

[l]张红亮，朱永琴，李 霞，等，植物多倍体育种的探讨[J].种子科技.2013，31（7）：40-42.

[2]彭静，魏岳荣，熊兴华，植物多倍体育种研究进展[J].中国农学通报，2010，26（11）：45-49.

[3]乔永刚，宋 芸.我国园艺植物多倍体育种研究进展[J].北方园艺，2002（6）：7-8.

[4]范国强，曹艳春，赵振利，等，白花泡桐同源四倍体的诱导[J].林业科学.2007，43（4）：31-35.

[5]魏真真.豫杂一号泡桐和南方泡桐同源四倍体诱导及其体外植株再生的研究[D].郑州：河南农业大学，2008.

[6]何佳.9501泡桐和悬铃木四倍体诱导的研究[D].郑州：河南农业大学，2010.

[7]王杨.楸叶泡桐和台湾泡桐四倍體诱导及其体外植株再生体系建立[D].郑州：河南农业大学，2014.

[8]张变莉，王杨，刘荣宁，等.台湾泡桐体细胞同源四倍体的诱导及鉴定[J].江苏农业科学，2016.44（6） ：290-293.

[9]韩同丽.四种泡桐体外植株再生体系建立[D].郑州：河南农业大学，2013.

[1O]Tambong J T， Sapra V T， Garton S.In vitro induction of tetra-ploids in colchicine - treated cocoyam plantLets[J]. Euphytica，1998，104（3）：191-197.

[ll]Jane Fiuza Rodrigues Portela de Carvalho， Carlos Roberto de Por-tela de Carvalho， Wagner Campos Otoni. In vttro induction ofpolyploidy in annatto （Bixa orellana） [J]. Plant Cell， Tissue andOrgan Culture， 2005， 80（1）： 69-75.

收稿日期：2019-09-11

基金项目：河南省郑州市普通科技攻关项目（编号：153PKJGG423）;河南省杰出人才创新基金项目（编号：321001700）;河南省高校杰出科研人才工程基金项目（编号：2002KYC-003）

作者简介：张变莉（1982 -），女，讲师，硕士，主要从事园林绿化及林木生物技术的教学和科研工作。

通讯作者：范国强（1964 -），男，教授，博士，主要从事泡桐生物技术的研究。