Y-l’苹果矮化砧木初代培养

王国平 刘伟 史华平 樊新萍

摘要：为建立苹果矮化砧木‘Y-1'初代培养体系，以大田'Y-1'当年生幼嫩枝条茎段为外植体，对消毒剂的选择、外植体采集时间和初代培养中植物生长调节剂的应用进行了研究。结果表明：先用75%酒精处理30s，再用0.1% HgCIz处理5 min是苹果矮化砧木‘Y-1茎段灭菌的最佳方法，其外植体成活率高达66. 46%;外植体最佳取材时间是5月初，接种后外植体的污染率明显低于它取材时间，而芽的成活率、萌发率则显著提高。MS+1.O mg/L 6 - BA+O.5 mg/L IBA是苹果矮化砧木‘Y-I茎段腋芽萌发的最适宜培养基，萌发率高达79. 15%;

关键词：‘Y-1苹果矮化砧木;初代培养;污染率;萌发率

中图分类号：S661.1

文献标识码：A

文章编号：1674-9944（ 2019） 24-0053-04

l 引言

‘Y-I苹果矮化砧木（原代码Y- B030），是山西省农业科学院果树研究所苹果砧木课题组从2001年开始，以苹果属野生砧木资源晋西北山定子（Malus bacca-ta）为材料，采用大群体实生选育技术，经过十年的区域试验和生产实践，选育出的抗逆性强、矮化效果明显、综合经济性状优良的苹果矮化砧木新品种，于2013年3月通过了山西省农作物品种审定委员会审定[1]。该砧木嫁接品种树体矮化、抗寒、抗旱、早花早果、亲和性好等特性极为突出，可在我国华北、西北、东北及类似晋西北自然条件寒冷、干旱、贫瘠的苹果产区栽培[2]。

多年来，‘Y-I苹果矮化砧木的推广主要通过中间砧形式[1]，利用这种嫁接方法，矮化砧木的特性不能充分体现，尤其在树体矮化、果实品质和树体适应性方面表现明显[3]。而且，育苗步骤要比常规育苗多嫁接一次，使得嫁接、田间苗木管理程序繁琐，延长了苗木出圃周期，费时费工，成本高。而自根砧育苗具有结果早、产量高、品质好、育苗方式简单、长势一致、繁育所需年限较短等优点，它对苹果树的生长、开花、结果、抗逆能力等产生直接影响，是目前高标准建园的最佳选择[4]。随着近年来苹果栽培产业的迅速发展，自根砧在生产实际中的重要作用尤为突出。我国苹果自根砧繁育技术相对薄弱，已成为制约我国苹果苗木良种良砧快速发展的一个瓶颈[5]。因此，进行‘Y-I苹果矮化砧木的无性繁殖研究，实现其自根苗的生产，使得砧木自身优势能够充分发挥，显得尤为重要。矮化自根砧苗的获得必须利用无性繁殖技术，而组织培养技术作为无性繁殖技术中的关键技术，以繁殖速度快、繁殖系数大，繁殖后代整齐一致，能够保持原有品种的优良性状，可以周年生产，经济效益高等优点被优先应用[6，7]。尤其是针对通过扦插、压条等无性繁殖技术方法难以获得‘Y-1苹果矮化砧自根苗，组织培养技术的应用就成为唯一选择。目前，‘Y-I'苹果矮化砧木组培方面的研究还未见报道。

在植物组织培养繁育中，初代培养是组织培养技术中的首要环节。本试验尝试通过以带腋芽的幼嫩茎段作为外植体，通过研究探索‘Y-1'苹果矮化砧木在组织培养中的外植体最佳消毒剂的选择、最佳外植体采集时间的确定和在不同植物生长调节剂组合的培养基上进行诱导效果对比，对‘Y-1苹果矮化砧木初代培养阶段技术进行研究。旨在为‘Y-1'苹果矮化砧木的快速繁殖和大力推广及工厂化生产提供理论及操作技术依据，以满足市场对‘Y-1苹果矮化砧木的迫切需求。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验材料来源

供试材料采自山西省农业科学院果树研究所苹果砧木课题组。在生长季节，选取生长健壮、洁净且无病虫害植株的新生幼嫩枝条，剪取30～40 cm的枝条，去掉叶片，叶柄留2～3 mm，装入保鲜袋中，用冰袋和干净的湿毛巾低温保存，立即带回组培室进行无菌化处理。

2.1.2 试验材料预处理

首先用小刷子蘸取肥皂液将附于枝条上的尘土和其他粘着物刷洗干净，随后用自来水冲洗0.5 h。将枝条截成单芽茎段，放入盛有无菌水的瓶中，带至无菌超净工作台上。在无菌超净工作台上，将放有单芽茎段瓶中的无菌水倒掉，用装有70%医用酒精的小喷壶将单芽茎段喷湿，约30 s后，将多余酒精倒掉，用不同消毒剂进行处理。

2.2 试验方法

2.2.1 不同消毒试剂及其不同浓度试验

在植物初培过程中，消毒剂主要有HgC12，过氧化氢、NaCIO等[8]。不同试验材料，对灭菌劑的种类和浓度要求各不同。在预试验的基础上，本试验主要用HgCI2和的NaCIO。HgCl2分3个浓度处理，分别为0. 05%，0.1%，0.15%;NaCIO分3个浓度处理，分别为10%，15%，20%。消毒剂浸泡时间为5 min。每个处理时间达到后，将浸泡好的单芽茎段用无菌水冲洗3次。将单个单芽茎段取出，在无菌接种盘上用无菌滤纸吸干材料表面水分，将茎段两则各剪去0. 3～0.5 cm，接种于MS培养基上（pH值为5.8），每瓶接种1个茎段，每个处理接种单芽茎段30个。7d后开始观察外植体污染及腋芽萌发情况，连续定期观察‘Y-I苹果矮化砧木茎段污染和生长情况20 d后，统计污染、成活和萌芽情况[9]，（以下做法类同）。其计算公式如下：

污染率=（污染数/接种数）×100%;

成活率=（成活数/接种数）×100%;

萌发率=（萌芽数/接种数）×100%。

2.2.2 不同取材时间试验

在初培试验中，由于试验材料均取于大田，不同时间段，其木质化程度和菌落均不同，消毒结果也截然不同[10]。为了确定外植体适宜的采集时间，从5月到8月，在不同时间进行了7次初培试验，具体时间分别为：5月5日、5月12日、5月27日、6月3日、6月20日、7月23日、8月24日。

2.2.3 初代培养植物生长调节剂配方筛选试验

初培获得无菌嫩枝，不仅取决于植物生长调节剂浓度，生长调节剂之间比例也是关键，该试验以MS为基础培养基，以生长素IBA和细胞分裂素BA作为试验因子，研究二者配合使用的效果。在预备试验的基础上，IBA浓度分别为：0.3 mg/L、0.5 mg/L、1.O mg/L; BA浓度分别为：1.O mg/L、1.5 mg/L、2.O mg/L。二者不同浓度进行完全组合试验。

2.3 培养基及培养条件

所用培养基为MS基本培养基，每升添加琼脂6 9，蔗糖30g，121℃灭菌20 min。外植体茎段接种后于培养室内培养，培养室中温度为（25±1）℃，光照强度为3000～4000 lx，光照周期为光/暗=16 h/8 h。

3 结果与分析

3.1 消毒剂种类及其不同浓度对‘Y-I外植体灭菌效果的影响

各灭菌处理的污染最初出现在接种后5d，随后增加。接种后5d时，发现部分培养瓶中的培养基表面变得粗糙、不光滑，有细菌污染的迹象，7d时部分试管瓶培养基中出现真菌菌落。首先在外植体的叶腋处出现少量白色的菌丝，随后逐步增多、扩大。到20 d时，真菌可以布满整个外植体，并以外植体接触培养基处为圆心，形成不同直径的菌层覆在培养基表面;细菌污染的主要表现在外植体与培养基接触处，形成不同大小的菌斑，颜色各异。

不同灭菌剂种类及其不同浓度处理对‘Y-1苹果矮化砧木外植体的污染率、成活率和萌发率影响十分明显。从表1可以看出，HgCI2和的NaClO处理外植体后，污染率随着二者浓度的增高而下降，但同时萌发率也随之下降。对比不同浓度HgCI。和NaCIO的处理，发现HgCl2的灭菌效果要好于NaCIO。其中，从污染率、成活率和萌发率综合考虑，以0. 1% HgC12浓度处理效果最好，成活率最高为66. 46%，同时污染率也不太高，为26. 73%，萌发率为74. 36%。

3.2不同取材时间对‘Y-I外植体灭菌效果的影响

由表2可知，取材时间对外植体‘Y-I，的污染率、成活率及萌芽率都有重要影响。其中，6、7、8月份的污染率显著高于5月份的，当5月份第一次取材时，其污染率仅为5. 71%，显著低于其它取材时间;就存活率而言，5月的成活率也显著高于6、7、8月份，其中5月5日取材的外植体存活率能达到65. 45%;不同取材时间的外植体在灭菌接种后的萌发率也是5月份最高。因此，5月初是‘Y-1'苹果矮化砧木外植体最佳取材时间。

3.3 ‘ Y-I初代培养植物生长调节剂配方筛选试验

试管苗的形成不仅取决于生长调节剂的浓度，还取决于生长调节剂之间的比例，该试验以MS为基础培养基，以生长素IBA和细胞分裂素BA作为供试因子，研究二者配合使用的效应，结果见表3。接种后1周左右，芽开始萌动;继续生长1周后，叶片逐渐展开。1月后观察不同激素种类和浓度下茎段侧芽萌发和成活情况。从表3可以看出，在诱导茎段侧芽萌发的试验中BAI.O mg/L，附加IBAO.5 mg/L的长势好，成活率最高，达68. 91%，萌发率也是最高，达79. 15%。因此，‘Y-I苹果矮化砧木外植体初培过程中，最适合茎段侧芽萌发的植物生长调节剂组合是BAI.O mg/L，附加IBAO.5 mg/L。

4 讨论与结论

4.1 灭菌剂

‘Y-I'苹果矮化砧木为多年生木本植物，生长在大田，附着在植物体上的菌类多且复杂，组织培养时不易消毒灭菌[11]。外植体消毒是组织培养的关键，不同灭菌剂对外植体的影响较大。正确选择灭菌剂的种类可以降低污染率，减少组织死亡，提高外植体的成活率和萌发率[12] ，。在多种植物组织培养过程中，都用HgCI2来消毒，且效果较好[13]。而用次氯酸钠虽然有一定的成活率，但污染率较高，这在本试验中进一步得到了证明。从表1可以看出，综合污染率、成活率和萌发率3个方面的统计数据，HgCI2的灭菌效果要好于NaClO。0.1% HgCI2处理5 min，成活率最高，为66. 46%，而15%NaCIO处理为NaCl03个处理中成活率最高的，也只有58. 65%。，污染率随着二者浓度的增高而下降，但同时萌发率也随之下降。对比不同浓度HgClz和NaCIO的处理，以0.1%HgCl2浓度处理效果最好，成活率最高为66. 46%，同时污染率也不太高，为26. 73%，萌发率为74. 36%。因此，对于Y-I苹果矮化砧木初培，选择0.1% HgCI2处理5 min，效果最好。

4.2 取材时间

通常外植体的消毒效果因外植体采集时期不同而有所差异。因为植物生长具有明显的季节周期性，不同的月份，因空气温度、湿度，光照时间等因素相差较大，直接影响到植物的生理状态[14]。因此，外植体不同采集时间，长势情况、菌类种类及累积等因素截然不同，必然会对试验结果产生重大的影响[15]。本试验通过不同取材时间对‘Y-1外植体灭菌效果的调查结果表明：当5月份第一次取材时，其污染率仅为5.71%，显著低于其它取材时间;就存活率而言，5月的成活率也显著高于6、7、8月份的，其中5月5日取材的外植体存活率能达到65.45%。7月份之后外植体污染率明显增高，8月的污染率高达75. 12%。这可能由于5月初，‘Y-I刚开始萌动不久，正值新梢生长旺盛期，还未完全木质化，生命力强，枝条暴露在空中的时间较短;同时，本地春季少雨，空气干燥。而随着在空气中暴露的时间增长，雨量的增大，外植体表面汇集的微生物越来越多，在灭菌时难以把表面的微生物杀死，导致污染率飙升。因此，5月初是‘Y-I苹果矮化砧木最佳外植体取材时间。

4.3 植物生长调节剂

初代培养过程中芽的诱导率由植物生长调节剂尤其是细胞分裂素和生长素共同决定，只有在两者的浓度配比都合适的情况下才能起到良好的诱导效果，当细胞分裂素浓度高于生长素浓度时对芽的诱导有利[16，17]。因此，在组织培养中要根据外植体确定合理的生长调节剂配比。本试验以MS为基本培养基，通过不同浓度6- BA和IBA的使用表明：在诱导‘Y-1'茎段侧芽萌发的试验中BA 1.O mg/L，附加IBA O.5 mg/l_的长势好，成活率最高，達68. 91%，萌发率也是最高，达79. 15%。因此，‘Y-I苹果矮化砧木外植体初培过程中，最适合茎段侧芽萌发的植物生长调节剂组合是BA1.O mg/L，附加IBA O.5 mg/L。

通过‘Y-I苹果矮化砧木外植体灭菌剂的筛选、采集时间的选择、生长调节剂的调配，建立了‘Y-1苹果矮化砧木初培的完整体系，为进一步建立‘Y-I苹果矮化砧木完整的组培快繁体系奠定了基础。

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收稿日期：2019-10-24

基金项目：山西省农业科学院特色农业技术攻关项目支持：‘Y-I苹果矮化砧木组织培养技术研究

作者简介：王国平（1971 -）.男，副研究员，主要从事果树无性繁殖技术研究。