二化螟APN1的原核表达及其与Cry2Aa蛋白的结合特性研究

刘 慧， 李 博， 牛 林， 邱 林， 王 永*

1湖北工程学院生命科学技术学院/特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验，湖北 孝感 432000； 2华中农业 大学植物科学技术学院/昆虫资源利用与害虫可持续治理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430070； 3广州 海关隶属南沙海关，广东 广州 511400； 4中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000； 5湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128

苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)属革兰氏阳性菌，在芽孢形成时会产生具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白，主要分为Cry蛋白和Cyt蛋白2类(Crickmoreetal.,1998)，其中Cry蛋白是最常见的杀虫蛋白。由于Bt杀虫蛋白具有比较好的高效性和专一性，被认为是良好的化学农药替代物，表达Bt蛋白的转基因作物和微生物杀虫剂也被广泛应用于害虫防治(Bravoetal.,2011)。由于20世纪90年代初期棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)大暴发，对我国棉花产业造成严重损失，对棉铃虫具有高效杀虫活性的转基因棉花(主要表达Cry1Ac)首先在我国广泛种植。转基因作物的种植面积不断扩大，由1997年的170万hm2增加至2016年的1.85亿hm2，其中抗虫转基因作物高达41% (ISAAA,2016; Wangetal.,2018))。然而,单一、大面积种植转基因作物增加了棉铃虫等靶标害虫的抗性风险，成为Cry蛋白在害虫防治中可持续利用的重大威胁(Hagenbucheretal.,2017; Von Kaneletal.,2016)。因此，明确Bt杀虫蛋白的杀虫机制和靶标害虫的抗性机理，对于可持续利用Bt蛋白防治害虫具有重要意义。

Bt蛋白发挥杀虫活性的重要前提是Cry蛋白能够与昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊(brush border membrane vesicle,BBMVs)上的受体蛋白结合(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前已报道的Cry杀虫蛋白受体主要包括钙黏蛋白(cadherin，CAD)、氨肽酶(aminopeptidase N，APN)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(Pardo-Lopezetal.,2013; Soberonetal.,2009)。此外，研究发现，V-ATP合成酶亚基A/B、ABC转运蛋白(ABCC2、ABCC3、ABCG1、ABCA2)和钠溶质转运体可与Cry蛋白结合，可能是潜在的Cry受体蛋白(Chenetal.,2010; Contrerasetal.,2013; Qiuetal.,2017b)。其中，APN作为Cry蛋白的受体功能已在烟草天蛾ManducasextaL.、烟芽夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius)、小菜蛾PlutellaxylostellaL.等鳞翅目昆虫中得到鉴定(Contrerasetal.,2013; Luoetal.,1997; Wangetal.,2017a)。

当前已报道的Cry基因超过500种，根据其结构特点和杀虫活性大致被分为67类 (Crickmoreetal.，2014)。由于不同类别的Bt杀虫蛋白存在杀虫特异性，不同杀虫蛋白对同一靶标害虫的杀虫效果不尽相同，同一昆虫体内也可能存在不同的受体蛋白(Frankenhuyzen,2009)。二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻上的重要害虫之一(Duetal.,2013)。由于水稻品种更新、气候变化、水稻耕作技术发展以及二化螟抗药性产生等因素的影响，二化螟在我国的危害程度持续上升(陈波等,2012)。目前，Cry2A类蛋白的受体鉴定和作用机制相关报道较少，因此，本文在前期获得二化螟APN1基因的基础上，分析其与Cry2Aa蛋白的结合能力，为二化螟APN蛋白的受体功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

二化螟为本实验室内以人工饲料(不含Bt蛋白)连续饲养多代的敏感种群，未接触任何杀虫剂。待幼虫生长至4龄，将其放置冰上切取中肠，去除内含物，用预冷的0.7%NaCl溶液冲洗并用吸水纸将其吸干，立即放入液氮中冷冻，收集的中肠样品放入-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

表达载体pET-28a-(+)、克隆感受态细胞Trans l-T1 Phage Resistant为实验室前期保存。反转录cDNA合成试剂盒和限制性内切酶(EcoRⅠ和NotⅠ)(Fermentas公司)，RNA提取试剂和DNA聚合酶(PrimeSTAR®Max DNA Polymerase)(Takara公司)，T载体peasy-blunt和感受态细胞Trans BL21(DE3)(全式金公司)，质粒提试剂盒和X-gal[天根生化科技(北京)有限公司]，DNA T4连接酶(Promega公司)、Cry2Aa活化蛋白(美国一龙公司Envirologix Inc.)。菌体破碎时使用的溶菌酶，PMSF，DNaseI，蛋白纯化时使用的填料(康为世纪生物科技有限公司)；PTG，硫酸卡那霉素胰蛋白胨，酵母提取物，氯化钠(武汉鼎国生物技术有限公司)。PCR引物合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。蛋白纯化所用的inclusion bingding buffer、inclusion elution buffer为自己配制，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 二化螟中肠RNA的提取及cDNA模板的合成

取10头二化螟4龄幼虫的中肠，放入无RNAase的1.5 mL离心管中，加入1000 μL的 Trizol reagent充分匀浆，用Takara公司的RNAiso Plus试剂盒进行总RNA的提取，将提取的RNA按照Thermo Scientific cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA。

1.4 APN1基因片段的克隆

1.4.1 引物设计 根据GenBank中二化螟APN1(JQ747494.1)的序列，在Cry2Aa蛋白结合区设计引物：APN1正向引物5′-AGGAATTCATGGACGGGATTGCCAAATC-3′，反向引物5′-AGGCGGCCGCTTTCAACATCAAAGCGATCATTGTTG-3′，为了便于将目的基因克隆到表达载体上，在正向、反向引物中分别设计了EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点(用下划线表示)。

1.4.2 PCR产物的克隆和鉴定 以合成的cDNA第一链为模板，按照说明书配制Prime STAR Max的PCR体系，1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段。将回收的目的片段连接到克隆载体peasy-blunt中，然后转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑挑选，挑取白色单菌落，培养后进行菌液PCR鉴定，将鉴定的阳性克隆进行测序鉴定。

1.5 APN1基因原核表达载体的构建及鉴定

1.5.1 质粒提取 对测序正确的单菌落菌液，1∶100加入10 mL带kana抗性的LB液体培养基过夜培养，采用TIANprep Mini Plasmid Kit进行质粒提取。

1.5.2 重组表达载体的构建 将重组的质粒peasy-blunt/APN1和原核表达载体pET-30a-(+)经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后，分别切胶回收1600、5000 bp左右的片段。在T4连接酶的作用下，将APN1片段与原核表达载体pET-30a-(+)于16 ℃过夜孵育。接着转化大肠杆菌DH5α，过夜培养，然后进行菌液PCR的鉴定及重组质粒的测序鉴定。

1.6 APN1多肽片段诱导表达并纯化

1.6.1 APN1多肽片段诱导表达 提取经鉴定正确的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂平板，过夜培养。挑取单菌落进行PCR验证，取阳性结果对应的菌液100 μL加入到10 mL Kana+LB液体培养基中，37 ℃、200 r·min-1振荡培养4 h，再转入1 L Kana+LB液体培养基中，D600 nm值达到0.5～0.8时，加IPTG至终浓度为1.0 mmol·L-1， 37 ℃恒温振荡培养6 h，12000g离心1 min，弃上清，所得沉淀为总蛋白，用于SDS-PAGE电泳及纯化。

1.6.2 APN1多肽片段纯化 将IPTG诱导后的蛋白加入LE buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-1Tris-HCl，8 mmol·L-1urea，pH8.0)溶解，4 ℃ 18000 r·min-1离心30 min，取上清至His-tag亲和层析柱，wash buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-11 Tris-HCl，10 mmol·L-1Imidazole，8 mmol·L-1urea，pH8.0)冲洗柱子。elution buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1Imidazole，8 mmol·L-1urea，pH8.0)洗脱目的蛋白。收集的纯化蛋白经SDS-PAGE电泳检测。

1.7 ligand bloting分析

将提取纯化的APN1片段进行SDS-PAGE分析，用Bio-Rad标准半干法转膜装置将蛋白转移至PVDF膜上，用PBST稀释的5%脱脂奶粉封闭2 h，与活化的Cry2Aa杀虫蛋白(0.3 μg·mL-1)孵育2 h；PBST洗膜10 min，重复3次；与Cry2Aa的抗体(1∶3500)孵育2 h；PBST洗膜10 min，重复3次；辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3500)孵育2 h；ECL化学发光显色，记录图片。

2 结果与分析

2.1 APN1在大肠杆菌表达纯化结果

结合GenBank已收录的APN1的全长，经过表达载体构建将目的基因构建到pET-30a-(+)表达载体上，转化BL21(DE3)感受态细胞以后，用终浓度1 mmol·L-1的IPTG诱导蛋白表达并纯化。如图1所示，在体外获得了二化螟APN1蛋白，诱导表达和纯化得到的蛋白大小一致，约70 Ku，与预测的蛋白大小相一致。纯化后的多肽条带单一，纯度较好，可以用于蛋白杂交实验。

图1 二化螟APN1的原核表达和纯化Fig.1 Prokaryotic expression and purification of C. suppressalis APN11:Marker; 2:未添加IPTG诱导的总蛋白；3:IPTG诱导的总蛋白；4:Ni2+柱纯化的蛋白。1: Marker; 2: No IPTG-induced total protein; 3: IPTG-induced total protein; 4: Purified protein by Ni2+ column.

2.2 Cry2Aa蛋白与APN1多肽片段的结合分析

将纯化后的APN1进行SDS-PAGE电泳后，采用ligand bloting技术，检验APN1片段和Cry2Aa的结合能力，结果如图2所示，表达的二化螟APN1多肽片段可以与活化的Cry2Aa杀虫蛋白结合，且结合条带随着重组蛋白上样量的降低而减弱。

图2 二化螟APN1蛋白与Cry2Aa蛋白的结合Fig.2 The binding of APN1 protein to Cry2Aa protein in C. suppressalis1:10 μL二化螟APN1蛋白；2:5 μL二化螟APN1蛋白。1: 10 μL of C. suppressalis APN1 protein; 2: 5 μL of C. suppressalis APN1 protein.

3 讨论

有关Cry蛋白的作用机制，普遍认为Cry蛋白被靶标昆虫取食后，在昆虫中肠碱性环境条件下溶解，原蛋白在中肠酶的作用下水解为活化的杀虫蛋白，活化的杀虫蛋白与昆虫中肠上皮细胞BBMVs上的特异性受体相结合后，经过复杂的相互作用插入到昆虫细胞膜的脂筏中，导致细胞内外离子通透性和渗透压改变，引起细胞裂解和幼虫死亡(Adangetal.,2014; Bravoetal.,2011; Qiuetal.,2017b)。

Cry蛋白发挥作用的前提是其能够与昆虫体内的特异性蛋白受体相结合，这也是Bt蛋白发挥作用非常关键的一步(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前已报道可以与Cry蛋白结合的蛋白中，其中一些已确认为Cry蛋白的受体蛋白，一部分可能是潜在的受体蛋白。1995年发现昆虫APN为Cry蛋白的结合蛋白，现已在超过20多种鳞翅目昆虫中得到证实(Qiuetal.,2017a)。APN1作为Cry1类蛋白受体已经在粉纹夜蛾Trichoplusisni(Hübner)、烟草天蛾、棉铃虫和二化螟中得到证实(Flores-Escobaretal.,2013; Tiewsiri & Wang,2011; Weietal.,2016; Zhangetal.,2009)。Wangetal. (2017b)发现RNAi敲除APN1基因能降低二化螟对Cry1Ac的敏感性。但由于不同类型的杀虫蛋白可能存在不同的受体蛋白，Cry2A与Cry1A类杀虫蛋白具有不同的作用机制(Weietal.,2015)。

蛋白质结合是Bt蛋白发挥杀虫活性的前提，但结合并不意味着就是蛋白受体。谷实夜蛾中APN1是Cry1Ac的受体蛋白，但不是Cry2Ab的受体(Weietal.,2016)。Cry1Ac和Cry2Aa蛋白能够与南方小花蝽OriussimilisZheng成虫体内的热激蛋白70相结合，但实验确认为非特异性结合(Wangetal.,2018)。肌动蛋白actin作为Cry1Ac蛋白的结合蛋白在烟草天蛾和棉铃虫蛋白质组中得到鉴定，在埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)中也可作为Cry4Ba的结合蛋白(Bayyareddyetal.,2009)。肌动蛋白与Cry蛋白的结合有可能破坏细胞骨架的正常功能(Chenetal.,2010; McNall & Adang,2003)，但肌动蛋白是否为Cry的受体蛋白至今还未明确。Qiuetal. (2017a)利用RNAi敲除2个氨基肽酶N基因(APN1和APN2)导致二化螟对Bt水稻品系TT51(Cry1Ab和Cry1Ac融合基因)和T1C-19(Cry1Ca基因)的敏感性降低，但对T2A-1品系(Cry2Aa基因)的敏感性无显著变化。本研究发现，Cry2Aa杀虫蛋白可以与原核表达的二化螟中肠APN1多肽片段结合，其与Cry2Aa之间的互作关系仍需进一步研究。