二化螟钙黏蛋白CAD1的原核表达及与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合

周 浩， 李 博， 牛 林， 邱 林， 王 永，*

1湖北工程学院生命科学技术学院/特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验，湖北 孝感 432000； 2华中农业大学植物科学技术学院/昆虫资源利用与害虫可持续治理湖北省重点实验室，湖北 武汉 430070； 3广州海关隶属南沙海关，广东 广州 511400； 4中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室，河南 安阳 455000； 5湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128

二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻的重要害虫，对水稻产量造成重大损失(Qiuetal.,2017)。长期以来二化螟的防治一直以化学农药为主，但大量长期使用化学农药使得二化螟产生抗药性，同时造成环境污染,危害人类健康(徐秀秀等，2013)。因此，寻找新型有效的防治方法刻不容缓(曹明章等，2004)。转基因抗虫水稻为防治二化螟提供了新思路，被认为是一种新的、可替代化学农药的、环境友好的控制害虫危害的策略(Tangetal.,2018)。利用转基因技术将苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis, Bt)杀虫基因作为外源基因导入农作物中，可以对标靶害虫起到良好的防治效果(Huetal.,2018)。

Bt伴孢晶体产生的Cry蛋白杀虫活性物质是目前主要应用的转基因蛋白(Bravoetal.,2011)。Cry蛋白对鳞翅目害虫的作用机制已有许多报道(Huetal.,2018)。Cry蛋白被害虫摄取后首先在昆虫消化道内溶解，在敏感害虫中肠蛋白酶的作用下被激活，活化的Cry蛋白转运至围食膜，与中肠上皮细胞刷状缘膜囊(brush border membrane vesicle,BBMV)膜上特异性蛋白受体相结合，通过一系列蛋白质相互作用，使中肠细胞裂解或细胞凋亡而导致虫体死亡(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前公认的2种模型即成孔模型和信号转导模型(Meloetal.,2016)。成孔模型中，蛋白与受体蛋白相结合，导致蛋白的寡聚化，进而形成穿孔，引起细胞渗漏裂解，虫体死亡(Bravoetal.,2004)；信号转导模型中，Cry蛋白与钙黏蛋白(cadherin，CAD)相互作用后激发了依赖Mg2+的信号级联途径，导致细胞凋亡而引起昆虫死亡(Zhangetal.,2005)。Jurat-Fuentes & Adang (2006)提出了成孔和信号转导共同作用的模型。无论是哪种模型，Cry蛋白与受体蛋白的结合是Cry蛋白杀虫活性的前提(Tanakaetal.,2013)。目前已有许多Cry蛋白受体蛋白得到鉴定，包括钙黏蛋白CAD、氨肽酶、碱性磷酸酶和ABC转运蛋白等(Bravoetal.,2011; Pardo-Lopezetal.,2013; Pigott & Ellar,2007; Qiuetal.,2017; Soberonetal.,2018)。

CAD是一类依赖于钙离子的细胞表面跨膜糖蛋白，在细胞裂解、细胞增殖与分化过程中起到重要作用，并能调控细胞外与胞质内的信号传导途径(Angstetal.,2001)。Vadlamudietal. (1993)首次在烟草天蛾ManducasextaL.中发现CAD是Cry1Ab蛋白的结合蛋白。此后，在不同类别的昆虫和不同种类的Cry蛋白相互作用中，许多昆虫的CAD作为Cry蛋白的结合或受体蛋白得到证实，如棉红铃虫Pectinophoragossypiella(Saunders)和欧洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hübner) (Flannaganetal.,2005; Morinetal.,2003)。此外，CAD的突变可导致CAD与Cry蛋白的蛋白质互作发生改变，进而导致昆虫产生抗性(Huetal.,2018)。破坏棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)的CAD基因与棉铃虫对Cry1Ac蛋白的遗传抗性相关(Wangetal.,2016)。

不同的Cry蛋白对不同的昆虫具有特异性，即使同一类别的昆虫也具有差异性(Parketal.,2014; Renetal.,2016)。与对Cry1Ac敏感的棉铃虫品系相比，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除HaCad基因，棉铃虫对Cry1Ac抗性增加549倍，但是Cry2Ab的敏感性无显著改变(Wangetal.,2016)。Cry蛋白在不同的细胞系中同样能够引起不同的细胞死亡反应。在Cry1Ac蛋白作用下，转染MsCAD的TnH5细胞能够激活PKA/AC通路引起的死亡反应，但是CF1细胞中Cry1Ac并不激活PKA/AC通路，而是引起细胞凋亡(Soberonetal.,2018)。CAD与Cry蛋白的互作随着鳞翅目昆虫种类的不同而变化(Stevensetal.,2017)。因此，不同类别的Cry蛋白与不同种类昆虫的CAD互作需要进行具体研究。

前期的研究结果表明，利用RNAi沉默二化螟CAD1基因后，二化螟对于Cry蛋白的敏感性下降，猜想二化螟CAD1是Cry2A和Cry1C的潜在受体(Zhangetal.,2017)。本研究构建原核表达载体获得二化螟CAD1蛋白，利用Ligand blot技术分析二化螟CAD1蛋白与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的结合能力，初步验证二化螟CAD的功能，为进一步阐明二化螟钙黏蛋白CAD1的Cry蛋白受体功能提供理论支持，也起到丰富和完善Bt蛋白杀虫机理的作用。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试昆虫为二化螟敏感品系，由本课题组室内培养20代以上。二化螟幼虫用人工饲料饲养，成虫喂以10%蔗糖水。培养条件：温度(27±1) ℃，光周期16 L∶8 D，相对湿度(65±10)%。

1.2 主要试剂

TaqDNA聚合酶(Takara公司)、胶回收试剂盒(Axygen公司)、peasy-T1载体和Trans BL21 (DE3)表达感受态细胞(全式金公司)、限制性内切酶(Fermentas公司)、T4 DNA连接酶(Promega公司)、10%SDS-PAGE凝胶配制所用的TEMED和Tris-base(武汉鼎国生物技术有限公司)、硝酸纤维素膜(NC膜)(Bio-rad公司)、ECL试剂盒(Thermo Scientific公司)、活化的CrylAc和Cry2Aa蛋白(美国一龙公司Envirologix Inc.)。Trans1-T1感受态细胞为本实验室保存，PBS、PBST缓冲液和蛋白纯化时所使用的Inclusion bingding buffer为本实验室配制，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 原核表达载体的构建与鉴定

根据已发表的二化螟CAD1基因序列(GenBank: DQ821523.2)，采用Primer3web在线设计特异性引物，正向引物5′-TGGGGATCCATGGTAGCGGACAGCAGCCTGG-3′，反向引物5′-TCCCTCGAGTAGCCGGAATTGCTTGTTGGTGAAC-3′，为了便于将目的基因克隆到表达载体上，在正向、反向引物中分别设计了NotI和XhoI酶切位点(下划线表示)。以二化螟中肠cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为20 μL：上下游引物各0.4 μL，模板1 μL，RNase-free Water 12.8 μL，LA TaqDNA聚合酶0.2 μL，LA Buffer 2.0 μL，dNTP 3.2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收纯化，连接到peasy-T1载体上，转化到Trans1-T1感受态细胞，培养后挑取阳性单克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。

NotI和XhoI双酶切含有CsCAD1的peasy-T1载体，经1%琼脂糖凝胶电泳纯化并回收酶切产物，用T4 DNA连接酶连接同样经过双酶切并回收的pET-28a-(+)载体，转化到Trans1-T1感受态细胞，培养后挑取阳性单克隆对其进行测序鉴定。

1.4 目的蛋白的诱导表达和鉴定

将测序正确的pET-28a-(+)-CsCAD1重组质粒1 μL加入100 μL Trans BL21感受态细菌中，加入800 μL的LB液体培养基，37 ℃振荡培养1 h，4000g离心2 min后，弃上清，留100 μL菌液重旋沉淀使其均匀，全部涂于含50 mg·L-1卡那霉素(Kana)的LB平板，37 ℃倒置培养过夜。第2天进行PCR验证，取10 μL单克隆正确的菌液，于10 mL Kana液体培养基中扩大培养至D600值达到0.5～0.8时，加IPTG至终浓度为1.0 mmol·L-1，于37 ℃继续诱导4 h，以不加IPTG诱导作为阴性对照。诱导结束后，取该表达菌株，12000g离心1 min，弃上清，向沉淀加100 μL 1×SDS缓冲液重悬菌体，100 ℃水浴5 min使蛋白变性，置于-20 ℃冰箱保存。之后进行SDS-PAGE电泳检测。

1.5 目的蛋白的Ni柱亲和纯化

由于二化螟CAD是以包涵体形式表达，需用10 mL含有8 mol·L-1尿素的Binding buffer平衡层析柱，另用含尿素的Binding buffer重悬沉淀，充分混匀，使包涵体溶解，4 ℃、12000g离心15 min，取上清液作为上样样品。往层析柱加入样品，盖紧盖子，封口膜封好，待其与层析柱充分结合，先用10 mL Binding Buffer洗脱杂蛋白，再用不同质量的咪唑和Binding Buffer配制成不同浓度的洗脱液(pH调至7.9)，依次洗脱目的蛋白并收集，从每管收集的纯化蛋白中取出10 μL作为样品，进行SDS-PAGE电泳检测。

1.6 Cry蛋白的定量制备

用PBS缓冲液溶解Cry1Ac、Cry2Aa的蛋白干粉，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，采用分光光度计法制作其标准曲线并测定样品浓度，配好的Cry蛋白置-80 ℃保存。

1.7 目的蛋白CsCAD1与Cry1Ac、Cry2Aa的结合分析

将纯化后的CsCAD1蛋白转移至NC膜，用含5%脱脂牛奶的PBST在室温下封闭2 h；分别转移至含有蛋白量4、2、1 μg的Cry1Ac、Cry2Aa的PBST中，37 ℃孵育2 h；用PBST洗涤NC膜6次，每次5 min；然后与Cry1Ac、Cry2Aa的抗体(1∶3500)孵育2 h，再用PBST洗涤NC膜6次，每次5 min；之后用辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3500)孵育2 h，待NC膜晾干，采用ECL试剂盒发光显色，显影液观察结果。

2 结果与分析

2.1 CsCAD1蛋白的诱导表达及纯化

将带有重组质粒CAD1—pET-28a-(+)的BL21菌株进行诱导表达，将目的蛋白进行SDS-PAGE检测，并以未加IPTG进行诱导作为阴性对照，从染色结果中可以看到，目的蛋白为一分子质量44 Ku左右的蛋白条带(图1A)，其分子质量与目的片段通过DNAman软件预测的蛋白分子质量相符合，初步表明目的蛋白成功表达。

将表达成功的目的蛋白经Ni柱纯化后，SDS-PAGE电泳显示其条带单一(图1B)，表明纯度较好，可用于后续Ligand blot分析与Cry蛋白的结合实验。

图1 二化螟CAD1蛋白的原核表达和纯化Fig.1 The prokaryotic expression and purification of C. suppressalis CAD1A:二化螟CAD1蛋白的原核表达。M，蛋白质标准品，未加IPTG诱导的总蛋白。2，IPTG诱导的总蛋白，箭头所示为诱导蛋白所在位置；B:二化螟CAD1蛋白的纯化，1～4分别为不同上样量的纯化蛋白。A: The prokaryotic expression of C. suppressalis CAD1. M， Protein standard. 1， Total protein induced without IPTG. 2， Total protein induced by IPTG. The arrow showed the location of the induced protein； B: The purification of C. suppressalis CAD1. 1～4， Purified proteins with different amounts.

2.2 CsCAD1蛋白与Cry1Ac、Cry2Aa的结合

为了检测CsCAD1蛋白能否与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白结合，进行了Ligand blot实验。先在NC膜上封闭CsCAD1蛋白，将蛋白量分别为4、2和1 μg的Cry1Ac或Cry2Aa蛋白与NC膜结合，再分别与Cry1Ac或Cry2Aa的抗体结合，加入辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合，最后进行显色反应。结果表明，Cry1Ac和Cry2Aa蛋白均能够与CsCAD1蛋白结合，并且随着Cry1Ac和Cry2Aa蛋白量的增加，CsCAD1蛋白与二者结合的条带更亮(图2)，表明在二化螟中CAD蛋白具有与Cry蛋白结合的能力，CAD1蛋白可能是Cry1Ac和Cry2Aa蛋白的潜在受体。

3 讨论

Cry蛋白与昆虫中肠BBMV上的蛋白相结合是其发挥杀虫活性的基础，也是Cry杀虫特异性的关键(Bravoetal.,2004)。2种公认的Cry蛋白作用机制中，CAD作为结合蛋白均参与Cry蛋白的杀虫活性。CAD是研究比较深入的受体蛋白，在不同的昆虫中，被鉴定为不同Cry蛋白的结合蛋白或受体，或者同一昆虫体内多个结合蛋白参与Cry的活性功能，已报道CAD和APN是二化螟体内Cry1Ad毒素的结合蛋白(Qiuetal.,2017)。本研究证实Cry1Ac和Cry2Aa蛋白可以与二化螟中肠的BBMVs结合，并能与原核表达的CsCAD1蛋白结合，这可能是Cry1Ac和Cry2Aa蛋白对二化螟起作用的重要机制。

图2 二化螟CAD1与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合Fig.2 Binding reaction of C. suppressalis CAD1 with Cry1Ac and Cry2Aa proteinA:二化螟CAD1蛋白与Cry1Ac蛋白的结合,M:蛋白质标准品；1～3依次为上样量4、2和1 μg的Cry1Ac蛋白。B:二化螟CAD1蛋白与Cry2Aa蛋白的结合，M:蛋白质标准品；1～3依次为上样量4、2和1 μg的Cry2Aa蛋白。A: Binding reaction of C. suppressalis CAD1 and the Cry1Ac protein. M， Protein Standard. 1～3， Cry1Ac toxin of 4 , 2 and 1 μg, respectively; B: Binding reaction of C. suppressalis CAD1 and the Cry2Aa protein. M， Protein Standard. 1～3， Cry1Ac toxin of 4 , 2 and 1 μg, respectively.

CAD定位于中肠上皮细胞，不同物种中CAD作为结合蛋白的功能并不相同，这已在部分鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫的中得到验证(Parketal.,2014)。一些鳞翅目昆虫体内CAD已经被鉴定为Cry1A蛋白的受体，如棉铃虫、棉红铃虫、甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner和欧洲玉米螟等(Flannaganetal.,2005; Morinetal.,2003; Wangetal.,2016)。由于昆虫物种的丰富性和Cry毒性的多样性，不同物种中CAD蛋白的作用差异较大(Renetal.,2016; Stevensetal.,2017)。甜菜夜蛾CAD蛋白报道作为Cry1Ca受体(Gongetal.,2015; Renetal.,2016)，然而，基因沉默其80%CAD基因表达仅导致其对Cry1Ca的敏感性降低50%，表明甜菜夜蛾体内还存在其他的Cry1Ca结合蛋白或受体(Gongetal.,2015; Renetal.,2016)。表达HvCAD (HeliothisvirescensCAD)的细胞可与Cry1A蛋白结合，但不能与Cry1Fa结合(Jurat-Fuentes & Adang,2006; Soberonetal.,2018)。相反，有报道Cry1A和Cry1Fa在H.virescens中肠膜上具有共同的结合位点，并且Cry1Ac抗性的Heliothisvirescens与Cry1Fa存在交互抗性(Gouldetal.,1995; Soberonetal.,2018)。后来研究表明，HvCAD是Cry1A类蛋白而不是Cry1Fa蛋白的唯一受体，交互抗性可能是与CAD不同的其他结合蛋白的突变引起的(Jurat-Fuentes & Adang,2006; Soberonetal.,2018)。小菜蛾Plutellaxylostella(L.)体内Cry1Ac的功能受体是ABCC2而不是CAD蛋白，CAD蛋白起辅助作用，其CAD在Bt作用机理中的重要性随着鳞翅目昆虫种类的不同而变化(Stevensetal.,2017)。小粉虫Alphitobiusdiaperinus(Panzer)体内一个185 ku AdCad1蛋白被鉴定为Cry3Bb蛋白的受体，沉默AdCad1基因导致小粉虫对Cry3Bb的敏感性明显降低(Huaetal.,2014)。双翅目昆虫中，CAD调节埃及伊蚊AedesAegypti(L.) Cry11Aa对其幼虫的毒性，沉默其CAD基因导致其对Cry11Aa的敏感性降低(Leeetal.,2015; Rodriguez-Almazanetal.,2012; Zhangetal.,2015)。研究显示,冈比亚按蚊AnophelesgambiaeGiles体内2个CAD基因中，AgCad1蛋白不是Cry11Ba的受体，AgCad2蛋白可能是Cry11Ba的功能受体(Huaetal.,2013)。同样，埃及伊蚊中，沉默CAD基因并不影响Cry4Ba的毒性，而沉默CAD基因导致幼虫对Cry11Aa展现较高的抗性(Rodriguez-Almazanetal.,2012; Soberonetal.,2018)。相反，转染SeCAD细胞并没有增加对Cry1Ac的敏感性，但却导致了对Cry1C蛋白的敏感(Renetal.,2016; Soberonetal.,2018)。

许多昆虫对Cry蛋白的作用机制和抗性机制存在明显差异，只有深入研究每个物种的具体情况才能更好地应用Cry蛋白进行害虫防治(Fabrick & Wu,2015)。对二化螟CAD蛋白最新研究发现，siRNA干扰CAD1或CAD2基因后二化螟幼虫具有低死亡率和高存活率，表明CAD1或CAD2基因的表达与Cry2A和Cry1C蛋白在二化螟体内的毒性相关(Zhangetal.,2017)。本研究结果进一步证实CAD1蛋白可与Cry1Ac和Cry2Aa蛋白相结合，是它们潜在的受体蛋白，为二化螟体内Cry蛋白的结合蛋白和/或潜在的受体蛋白的研究提供基础。