基于SSR标记构建中国芍药品种资源分子身份证

万映伶，张 嘉，刘爱青，张孔英，刘 燕

(1北京林业大学 园林学院，花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室/国家花卉工程技术研究中心/城乡生态环境北京实验室,北京 100083；2菏泽市曹州牡丹园管理处，山东 菏泽 274000；3 洛阳国际牡丹园，河南 洛阳471000)

芍药(Paeonialactiflora)为芍药科芍药属多年生草本植物，是中国传统名花，近年来在国际切花市场上所占份额逐年递增。美国现有芍药品种(含伊藤杂种)已达上千个[1]，且数量还在不断增加。芍药在我国中原地区的主要栽培地为山东省菏泽市和河南省洛阳市[2]，虽然已有部分学者对两地的芍药品种资源进行过调查研究[3-7]，但年份较早，且不同学者记载的品种数量差异较大，因此尚不明确目前中国芍药品种资源的数量，这不利于我国芍药品种资源的开发利用。

进行品种鉴定的常用方法是利用形态特征进行鉴定，但这不仅需要鉴定者有丰富的品种识别经验，鉴定时间也仅局限在花期，而利用分子标记构建分子身份证区别品种，则不受这些因素限制。分子标记的类型有多种，目前研究者利用SSR、RAPD、SRAP等标记构建出了杂交水稻[8]、桃[9-10]、梨[11]、南瓜[12]和仁用杏[13]等农作物，以及百合[14]、欧美芍药[15]、国兰[16]和莲[17]等观赏植物的分子身份证。其中SSR标记以其在真核生物基因组中分布广泛、呈共显性遗传、重复性好及实验成本相对低廉等特性，成为构建分子身份证的重要标记。但SSR序列两侧区域在种间的保守性较低，需进行标记开发。目前芍药属物种已有一定的SSR标记基础[18-22]，主要用于种质区分、杂种鉴定和遗传关系研究等方面。张建军等[15]筛选出10对SSR引物，并构建了61个引进芍药品种的指纹图谱与指纹代码。刘建鑫等[23]用7对SSR引物鉴定了以‘朱砂判’为母本，以6个芍药组品种和4个牡丹组品种为父本的杂交后代，确定了其中4种组合的后代为真杂种。Zhang等[24]利用7对EST-SSR引物，分析了56个牡丹种及品种的亲缘关系，结果与基于传统品种划分法的结论一致。Wu等[25]利用30对EST-SSR引物，探究了56个芍药属种质的遗传关系，聚类结果中，芍药组与牡丹组首先分离，40个牡丹品种进一步聚为4个品种群，这与供试材料现实品种起源具有一致性。但有关中国芍药品种的分子身份证研究较少，仅张嘉等[26]利用4对引物绘制了66个芍药品种的分子身份证。

本研究在明确中国中原地区观赏芍药品种资源数量的基础上，利用21对SSR引物，构建了268个中国芍药品种的分子身份证，以期为保护与开发芍药品种资源、防止资源流失提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验于2014-2017年在北京林业大学国家花卉工程技术研究中心实验室进行。材料于每年4-5月花期在山东省菏泽市曹州牡丹园、菏泽市百花园、菏泽市傲阳牡丹种植专业合作社、菏泽市牡丹区马岭岗镇吴桥村与河南省洛阳市国际牡丹园分别收集，共计268个品种，其中含12个国际牡丹园未定名品种。每个品种随机选取3株，取上部幼嫩单叶，液氮处理后于-80 ℃冰箱储存。

1.2 DNA提取及PCR扩增体系

叶片基因组DNA提取采用试剂盒法(天根，DP320)。用紫外分光光度计检测所提取DNA的纯度和浓度，将合格样品稀释至30 ng/μL，并于-20 ℃冰箱中保存备用。采用课题组前期筛选的21对SSR荧光引物进行PCR反应[25]。反应总体系10 μL：5 μL 2×TaqMasterMix，0.5 μL Forward Primer，0.5 μL Reverse Primer，1 μL Template DNA，3 μL ddH2O。PCR反应在ABI VERITY 梯度PCR仪上进行。扩增程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。将扩增产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳检测。

1.3 数据统计分析

利用GeneMarker V2.2.0 (35 Days Val) 软件对原始数据进行分析，得到不同样品扩增片段长度。用Microsatellite Toolkit分析等位基因数及多态性信息含量 (polymorphism information content,PIC) 。利用GenALEx 6.41分析平均等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)等遗传多样性参数。

分子身份证的编制方法为：每个品种的身份证均为21位，按PIC值从高至低依次组合。每位数字均按扩增片段从小到大的顺序，依次按数字1-9和大写英文字母A-Z的顺序编码，若扩增片段的类型超过35种，则继续用小写英文字母a-z编码。

2 结果与分析

2.1 引物多态性分析

用21对引物 在268个芍药品种中共扩增出613条条带，多态位点率为100%；各引物的PIC值为0.508～0.846；各引物条带数为9～52，平均每对引物能扩增出21.14条，片段长度为91～419 bp。用21对引物共检测到242个等位位点，平均每对引物12个。21对引物在268个品种组成的群体中的遗传多样性见表1。有效等位基因数(Ne)为4.324±0.315，观测杂合度(Ho)为0.593±0.047，期望杂合度(He)为0.741±0.020。图1为引物C9在4个芍药品种中的扩增位点峰图。

表1 基于21对引物的268个芍药品种的遗传多样性Table 1 Genetic diversity of 268 herbaceous cultivars based on 21 pairs of primers

图1 引物C9在4个芍药品种上的扩增带型Fig.1 Amplification genotypes of primer C9 in four cultivars

2.2 268个芍药品种分子身份证的构建

每对引物在芍药样品中扩增出的片段长度构成每一位身份证编码数字的信息。本研究中21对引物的排列顺序为：P153、K73、P209、J38、J16、C26、C27、C10、J30、C15、P180、K21、J12、K39、P20、C9、J36、J29、J28、C19、K116。以引物C26为例说明编码方式，带型编码见表2。268个芍药品种的身份证见表3。

表2 引物C26所有带型对应的编码Table 2 Codes of all amplified bands in primer C26

注：-指未获得扩增带型。

Note:-means non-amplified SSR pattern.

表3 268个芍药品种的身份证代码Table 3 Molecular ID of 268 herbaceous peony cultivars

表3(续) Contuinued Table 3

表3(续) Contuinued Table 3

注：序号1～83样品采自河南洛阳国际牡丹园，序号84～226样品采自山东菏泽曹州牡丹园，序号227～248样品采自山东菏泽百花园，序号249～258样品采自山东菏泽傲阳牡丹种植专业合作社，序号259～268样品采自山东菏泽市牡丹区马岭岗镇吴桥村。

Note:No.1-83 cultivars were from Luoyang International Peony Garden,Henan.No.84-226 were from Caozhou Peony Garden，Shandong.No.227-248 were from Heze Baihua Garden,Shandong.No.249-258 were from Heze Aoyang Peony Cultivated Professional Cooperatives,Shandong.No.259-268 were from Wuqiao village,Malinggang town,Peony district,Heze,Shandong.

3 讨 论

本研究在对中国芍药品种资源进行调查的基础上，利用21对SSR标记，采用数字和大小写英文字母结合的方法，成功构建了268个芍药品种的分子身份证，平均每对引物等位基因位点12个，是区分中国芍药品种的有效方法。

植物品种资源开发利用工作的基础是明确品种特点、类型与数量。本研究基本确定了目前中原地区的中国芍药品种资源数量。山东菏泽作为国内芍药的主要栽培地之一，历史上品种数量曾达418种，但据本课题组近3年的调研统计，菏泽目前仅有芍药品种141个，品种流失率达66.3%。提示应将中国现有芍药品种登记在册，联合各单位每年进行品种增减的统计工作，方有利于品种保存、交流与新品种培育。从构建出的身份证来看，部分品种信息极为相似，21位编码中仅有1或2位不一致。如‘山河红’和‘竹叶红’仅身份证第5位不一致，‘袭人’和‘俏袭人’仅第18位不一致。对于这些品种，建议进一步确认其各自形态特征和物候记录，以确定是否可以合并为一个品种。通过构建分子身份证还发现，由于地方口音和品种俗名接近，造成部分品种同音异字或同种异名现象，如‘俏袭人’有时被称为‘玉翠荷花’，但身份证信息显示‘俏袭人’与‘玉翠荷花’并非同一品种。

遗传多样性高低是决定引物区分样品数量能力的关键。高源等[27]利用16对SSR引物在314份苹果栽培品种中进行扩增，平均每对引物有等位基因22.3个，仅用6对核心引物就构建出了314份苹果资源的TP-M13-SSR指纹图谱。本研究平均每对引物等位基因位点仅有12个，这是由于苹果已进行全基因组测序，标记选择更为容易，而目前对芍药的SSR标记开发有限。张嘉等[26]利用4对SSR引物区分了66个中国芍药品种，但4对引物的区分能力有限，无法进一步鉴别更多的中国芍药品种。张建军等[15]利用10对SSR引物区分了61个引进观赏芍药品种，平均每对引物等位基因位点为10.9个，与本研究接近。因此未来需进一步开发芍药SSR分子标记。SSR标记可分为基因组SSR和EST-SSR，相比之下，基因组SSR的开发费时费力、价格昂贵[28]，而EST-SSR则被发现可能与控制某些重要农艺性状的功能基因紧密连锁[29]。目前EST-SSR已在与芍药同属的牡丹中得到应用。Wu等[25]通过对牡丹转录组Unigenes序列的分析，鉴定出4 373个EST-SSRs，并在此基础上成功发掘出149对具有多态性的引物，其中有5个标记与株高、顶小叶长和柱头颜色等6个性状显著关联[30]。因此今后对芍药进行研究时，可在转录组测序基础上，力争多开发EST-SSR标记，以寻找与观赏性状直接相关的标记，利用一个或多个标记体现该品种花型、花色等特性，从而使芍药品种的分子身份证不仅可用来鉴定品种，还能为用来快速鉴别不同品种的观赏特性提供一定的参考。