犬埃立克体多表位融合抗原蛋白的免疫学特性研究

李重阳，孟庆玲，乔 军，伍晔晖，王立霞，郭 晶，马 帅，才学鹏

(1 石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003；2 中国农业科学院 兰州兽医研究所，甘肃 兰州 730046)

犬埃立克体(Ehrlichiacanis)属无形体科，为细胞内革兰氏阴性菌，是形成犬单核细胞埃立克体病(Canine monocytic ehrlichiosis,CME)的病原体。临床上，埃立克体病犬会出现发热、嗜睡、淡漠、厌食、黏膜苍白、脾脏肿大、出血[1]等症状，随后成为亚临床持续携带者[2]，大多数病犬伴有白细胞和血小板减少等血象的改变，严重感染者可累及多种脏器并导致死亡，蜱为该病的主要传播媒介。1935年CME在阿尔及利亚第一次被报道，1987年在美国首次报告人类单核细胞性埃立克体病， 1991年分离到其病原体查菲埃立克体[3-4]。随后该病在欧洲[5]、亚洲[6]和非洲[7]的一些国家相继被检测到。

我国已证实存在多种埃立克体和犬埃立克体，20世纪末我国南方某些地区发生犬成批死亡,可能与CME的流行有关[8-9]。目前，埃立克体病的诊断和流行病学调查主要依靠血清学检测，包括点滴ELISA或ELISA、免疫印迹测定、分子生物学技术及使用较少的细胞培养等方法[10]。由于埃立克体是严格细胞内寄生的病原体，它的体外细胞培养需要特殊的宿主细胞、严格的细胞培养条件和较昂贵的设备，所以难以制备大量全细胞抗原供临床检测使用。

犬埃立克体基因组已被测序，并鉴定出与病原感染宿主相关的富含丝氨酸的主要免疫蛋白[11]，包括gp200、gp140、gp36和 gp19等[12-14]，这些蛋白与免疫反应密切相关。为了构建和制备具有较强抗原性的犬埃立克体重组蛋白，本研究利用ABCpred等软件预测分析犬埃立克体 gp19、gp200和gp140 3种膜蛋白的优势抗原表位，经柔性氨基酸串联融合成功构建多表位融合抗原基因，优化其大肠杆菌稀有密码子后送至公司合成，克隆入大肠杆菌进行表达，制备了重组蛋白E.canis-megp19及E.canis-megp-1，并通过Western blot分析研究这2种重组蛋白的抗原性，以期为犬埃立克体病血清学诊断和疫苗的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

pET-32a(+)、大肠杆菌 DH5α和BL21(DE3)质粒、犬埃立克体阳性血清，由石河子大学动物科技学院寄生虫实验室保存；pMD19-T载体，DNA Marker，核酸限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ，T4 DNA Ligase和蛋白Marker，购自TaKaRa公司；HRP兔抗犬IgG，购自北京博奥森生物技术有限公司；犬埃立克体ELISA抗体检测试剂盒，购自上海泛科实业有限公司；昆明系雌鼠，购自石河子大学实验动物养殖中心。

高速冷冻离心机(Sigma,3-16PK)，去离子水生成仪(Bio-Rad)，小型高速离心机(Eppendorf,SG-800)，UVP全自动凝胶成像系统(Syngene,USA)，电热恒温水浴锅(DJ-8D)，恒温摇床(HWY-100B)，微波炉(HR-7751MS)，超低温冰箱(Thermo)，数显高压蒸汽灭菌锅(MLS-3780)，涡旋混合器(VORTEX-6)，超净工作台(BHC-1300A/B3)，电子天平(Mettler AE240)，制冰机(Bio-Rad)。

1.2 gp19、gp200和gp140蛋白优势线性抗原表位的预测

运用ABCpred(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)等在线软件和DNAStar-Protean[15],预测分析gp19、gp140和 gp200蛋白的抗原表位，根据预测结果筛选出优势抗原表位，选取排列组合得分较高的一组，用于构建多表位融合基因。

1.3 多表位融合抗原基因的构建与合成

将不同表位氨基酸序列对应的核苷酸序列,通过柔性肽编码序列按照最佳顺序进行连接，得到多表位融合基因E.canis-megp19和E.canis-megp-1。运用在线软件Racc(http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)对多表位融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，将其优化为大肠杆菌偏爱密码子。将优化后的多表位融合基因送至华大基因科技股份有限公司进行基因合成。

1.4 多表位融合抗原基因重组表达载体的构建与鉴定

根据合成的E.canis-megp19和E.canis-megp-1的基因序列，利用Primer 5.0设计特异性引物，在上、下游引物中分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点(引物序列中加下划线部分)。E.canis-megp19上游引物：5′-CGGAATTCATGGAT-ACTGTTGCACATTGT-3′，下游引物：5′-CCCTCGAGTTAACAGTTGTAATAACACGCAT-3′；E.canis-megp-1上游引物：5′-CGGAATTCATGGA-TCATTCTACATGTG-3′，下游引物：5′-CCCTCGAGTTAACGCTGACATTCTAC-3′，引物由华大基因生物公司合成。

PCR采用20 μL反应体系：ddH2O 12.9 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，模板2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 μL，上、下游引物各0.4 μL。E.canis-megp19 PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，扩增35个循环；72 ℃延伸7 min。E.canis-megp-1反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，扩增35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳验证。回收PCR产物，将其克隆入pET-32a(+) 质粒中，筛选阳性克隆提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳验证，设pET-32a(+) 空载体质粒为对照，将鉴定正确的重组表达质粒命名为pET-32a(+)-E.canis-megp19、pET-32a(+)-E.canis-megp-1。

1.5 多表位融合抗原蛋白的诱导表达与Western blot分析

1.5.1 IPTG最适诱导表达浓度 将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) 中，次日挑取单个阳性菌落于37 ℃摇菌过夜，取200 μL菌液接种于20 mL具Amp抗性的液体LB培养基中培养3～4 h，分别用0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mmol/L IPTG于37 ℃诱导6 h，12 000 r/min离心1 min收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，同时设置转化pET-32a(+) 空载体的BL21 (DE3)表达菌为阴性对照，筛选IPTG最适诱导浓度。

1.5.2 IPTG最适诱导表达温度 将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)中，次日挑取单个阳性菌落于37 ℃摇菌过夜，取200 μL菌液接种于20 mL具Amp抗性的液体LB培养基中培养3～4 h，加入终浓度1.0 mmol/L IPTG分别在16,24,30和37 ℃条件下诱导6 h，12 000 r/min离心1 min收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，同时设置转化pET-32a(+) 空载体的BL21 (DE3)表达菌为阴性对照，筛选最适诱导温度。

1.5.3 IPTG诱导表达最佳时长 将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) 中，次日挑取单个阳性菌落于37 ℃摇菌过夜，取200 μL菌液接种于20 mL具Amp抗性的液体LB培养基中培养3～4 h，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，分别在37 ℃继续诱导4,6和8 h，12 000 r/min离心1 min收集菌体，进行SDS-PAGE电泳分析，同时设置转化pET-32a(+) 空载体的BL21 (DE3) 表达菌对照和未加IPTG诱导的重组菌对照,筛选最佳诱导时长。

1.5.4 Western blot分析 利用犬埃立克体阳性血清作为一抗，HRP标记的兔抗犬IgG作为二抗，对多表位融合抗原蛋白进行Western blot分析。

1.6 多表位融合抗原蛋白的小鼠免疫试验

用Ni亲和层析柱纯化重组多表位融合抗原蛋白E.canis-megp19及E.canis-megp-1，其蛋白质量浓度分别为2.1和3.0 mg/mL。对纯化的蛋白进行Western blot分析。将12只25日龄的昆明系小鼠，分成试验组和对照组，试验组：重组蛋白溶液+弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合；对照组：PBS缓冲液+弗氏完全佐剂按体积比1∶1混合。采用皮下多点注射方式进行首次免疫，免疫剂量为200 μL。首免14 d 后进行二次免疫，7 d后采血，分离血清，并通过商品化犬埃立克体ELISA抗体检测试剂盒进行检测。

2 结果与分析

2.1 抗原表位的预测及多表位融合基因的合成

运用ABCpred等在线软件及DNAStar-Protean预测gp19、gp140和gp200蛋白的抗原表位，筛选出优势抗原表位(表1)。按照最佳顺序进行连接，得到多表位融合基因E.canis-megp19和E.canis-megp-1(表2)，对其大肠杆菌稀有密码子进行优化，结果如图1和图2所示。将最终得到的E.canis-megp-1和E.canis-megp19送至华大基因生物公司进行基因合成。

表1 抗原蛋白的优势线性表位序列Table 1 List of peptide sequences selected from antigen proteins

表2 多表位融合蛋白的组合顺序Table 2 Permutation and combination pattern of multi-epitope fusion protein

每3行一组的数据中，第1行为氨基酸序列,第2行为优化前的核苷酸序列,第3行为优化后的核苷酸序列；方框标示柔性氨基酸及其编码碱基序列；下划线标示大肠杆菌稀有密码子；双下划线标示优化后的核苷酸序列；下图同Among the every 3 lines of data:Line 1.Amino acid sequence;Line 2.Original nucleotide sequence;Line 3.Optimized nucleotide sequence.Flexible amino acid sequence and its coding base sequence were marked with character border;Rare codon of E.coli was marked with underline;Optimized nucleotide sequence was marked with double lines.The same below图1 犬埃立克体多表位融合抗原基因E.canis-megp-1的氨基酸序列及其相对应优化前后的核苷酸序列Fig.1 Amino acid sequence of multiple epitope fusion antigen gene E.canis-megp-1 and its original and optimized nucleotide sequence

图2 犬埃立克体多表位融合抗原基因E.canis-megp19的氨基酸序列及其相对应优化前后的核苷酸序列Fig.2 Amino acid sequence of multiple epitope fusion antigen gene E.canis-megp19 and its original and optimized nucleotide sequence

2.2 多表位融合抗原基因的扩增及重组表达载体的鉴定

利用特异性引物成功扩增出E.canis-megp19和E.canis-megp-1，其长度分别为414和429 bp(图3)。重组质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后得到了预期长度的目的片段和pET-32a(+)片段(图4)，表明成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-E.canis-megp19和pET-32a(+)-E.canis-megp-1。

M.DNA Marker；1～3.PCR产物 M.DNA Marker;1-3.PCR products

M.DNA Marker；1和4.重组载体EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切产物；2,3,5.pET-32a(+)空载体质粒对照M.DNA Marker;1 and 4.The recombinant vector digested by EcoRⅠ and XhoⅠ；2,3,5.pET-32a(+) empty vector plasmid as the contrast

2.3 多表位融合抗原基因的SDS-PAGE与Western blot分析

SDS-PAGE分析结果表明，重组蛋白E.canis-megp19的表达量不会随着IPTG浓度的增加而增大(图5-A)，故确定IPTG最适诱导浓度为1.0 mmol/L；随温度的升高，重组蛋白表达量不增大(图5-B)，故确定最适诱导温度为37 ℃。重组蛋白E.canis-megp-1表达的IPTG浓度和温度优化结果与E.canis-megp19一致。由图6可知，重组蛋白E.canis-megp19和E.canis-megp-1均在诱导8 h表达量最高，分别在38和39 ku处有明显条带。Western blot分析表明，纯化前后E.canis-megp19和E.canis-megp-1重组蛋白均可被犬埃立克体阳性血清所识别，并产生特异性的免疫反应，提示重组蛋白具有较好的反应原性(图7)。

M.蛋白分子质量标准；N.pET-32a(+)空载体表达菌(阴性对照)；1～6.分别为0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 mmol/L IPTG下的表达产物；7～10.分别为16,24,30和37 ℃下的表达产物M.Protein Marker;N.pET-32a(+) empty vector expressing bacteria (negative control);1-6.The expression products under 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 and 3.0 mmol/L IPTG,respectively;7-10.The expression products under 16,24,30 and 37 ℃,respectively

M.蛋白分子质量标准；1.pET-32a(+) 空载体表达菌(阴性对照)；2.未加IPTG诱导的重组菌对照；3～5.分别为重组菌株IPTG诱导4,6和8 h的表达产物M.Protein Marker;1.pET-32a(+) empty vector expressing bacteria (negative control);2.The recombinant bacteria not induced by IPTG (control);3-5.The expression products at 4,6 and 8 h induced by IPTG图6 犬埃立克体多表位融合抗原重组蛋白E.canis-megp19(A)和E.canis-megp-1(B)不同时间诱导表达产物的SDS-PAGE分析Fig.6 Expression products of multiple epitope fusion antigen recombinant proteins E.canis-megp19 (A) and E.canis-megp-1 (B) by SDS-PAGE with different time

M.蛋白分子质量标准；1.pET-32a(+)空载体表达菌；2,3.分别为纯化前后的重组蛋白M.Protein Marker;1.pET-32a(+) empty vector expressing bacteria;2,3.Recombinant protein before and after purification图7 犬埃立克体多表位融合抗原重组蛋白E.canis-megp19(A)和E.canis-megp-1(B)的Western blot分析Fig.7 Analysis of multiple epitope fusion antigen recombinant protein E.canis-megp19 (A) and E.canis-megp-1(B) by Western blot

2.4 多表位融合抗原蛋白的小鼠免疫试验

小鼠免疫试验结果表明，多表位抗原重组蛋白E.canis-megp19和E.canis-megp-1免疫小鼠后的血清均呈阳性，抗体效价高于1∶128，表明这2种多表位重组蛋白均可刺激机体产生特异性抗体。

3 讨 论

研究人员利用血清学方法检测到我国云南地区的人和犬血清中存在埃立克体抗体，并用PCR在蜱体内扩增到查菲埃立克体和犬埃立克体基因片段，证实了犬埃立克体病在我国的流行[16-17]。目前，犬埃立克体病诊断常用的方法有病原分离、血清学检测和PCR检测。PCR检测虽然具有高特异性和敏感性等优点，但容易引起假阳性[18]。血清学检测敏感性较差，但由于操作简单且重复性好，因此目前仍是埃立克体病诊断的常用方法。Cárdenas等[19]利用E.canis重组抗原检测犬血清中抗体时，发现p28特异性较低(约60%)，gp36、gp19和gp200的特异性为100%，但gp200产生反应的时间较晚，一般在感染后28～35 d可检测到抗体。免疫印迹检测抗体发现，gp36和gp19重组蛋白最快在感染2周后的血清中可检测到抗体[19-20]。蹇锐等[18]通过在E.coli细胞内高效表达查菲埃立克体P28融合蛋白，以该重组蛋白作抗原与犬血清进行免疫印迹，结果与已知的犬埃立克体感染血清呈阳性反应，与正常犬血清反应为阴性，在165份来自犬埃立克体病疫区的待检犬血清中有43份(26%)与P28反应呈阳性；2002年利用查菲埃立克体P28蛋白抗原免疫印迹法对犬单核细胞埃立克体病作流行病学调查，结果在212份犬血清中检测到89份(42%)呈阳性[21]。

以血清学为基础的诊断以及疫苗的研发依赖于犬埃立克体抗原蛋白的研究。目前已经发现的免疫活性蛋白包括gp200、gp140、gp36、gp19、p28/p30和主要膜蛋白2(map2)[22]等，其中gp36、gp140、gp200和p28均为糖蛋白类，富含丝氨酸和苏氨酸[11]，gp140和gp200存在于所有菌株中且相对保守[23]；gp200可被转移到细胞核，与染色质相互作用[11]，潜在地调节宿主细胞基因表达[24]。gp36变异最大，能够引发针对串联重复区早期抗体的应答，可用于基因分型。gp19具有很强的反应性且存在于所有E.canis分离株，且gp19是一种物种特异性抗原，可以区分E.canis和E.chaffeensis感染犬的血清，显示出对早期急性期抗体检测的高灵敏度[19]。E.canisp28/p30同样高度保守[25]，p28蛋白质是从30 ku蛋白质翻译成熟的28 ku蛋白质，其免疫反应性肽位于蛋白质的可变区。目前研究发现，gp200是E.canis中鉴定的最大的主要免疫反应性蛋白，是分泌型核转位含锚蛋白重复序列蛋白，位于末端酸性结构域中，具有5个主要物种特异性表位[26]；gp140串联重复区中含有强抗体表位；gp19具有富含丝氨酸的表位，这表明该蛋白质可广泛适用于免疫诊断和疫苗。

与单个抗原蛋白相比，多表位融合抗原增加了一些抗原结合位点，因而能够有效增强免疫原性，更好地诱导免疫应答，在血清学检测应用中，多表位抗原大大增加了检测的特异性，并在一定程度上能对易变异的病原微生物产生较好的免疫保护作用。因此本研究选取E.canisgp200、gp140和gp19这3种在不同地域分散的犬埃立克体菌株中抗原高度保守免疫蛋白作为研究对象，利用ABCpred等软件预测分析3种免疫蛋白的优势线性抗原表位，并筛选出3种膜蛋白的优势抗原表位，经柔性氨基酸串联融合成功构建多表位融合抗原基因，将其克隆入大肠杆菌进行表达，制备了重组蛋白E.canis-megp19及E.canis-megp-1；SDS-PAGE和Western blot分析证实，这2种重组蛋白均可被犬埃立克体阳性血清所识别，并产生特异性的免疫反应；多表位重组蛋白E.canis-megp19和E.canis-megp-1免疫小鼠后的血清均呈阳性，提示这2种多表位重组蛋白可刺激机体产生相应的特异性抗体。本试验对多表位重组蛋白E.canis-megp19和E.canis-megp-1的高效率表达，为基于该重组蛋白的犬埃立克体病的血清学诊断试剂和疫苗的研发奠定了前期基础。