木犀草素对结肠癌细胞抑癌基因RECK表达的影响及机制研究

魏付桥 阳乐彬 王春云 邓豪 唐金涛 谢文彪

421001南华大学附属第二医院胃肠外科，湖南 衡阳

结直肠癌是胃肠外科最常见的恶性肿瘤。随着我国人民生活水平的提高，蛋白摄入量日益增多，近年来结直肠癌的发病率逐渐增高。因此开展本病研究有利于提高本病的治愈水平。和其他恶性肿瘤一样，结直肠癌的发病也是细胞增殖与凋亡失调的结果，从基因角度来说，涉及癌基因与抑癌基因的改变。RECK 是近年来发现的一种新型抑癌基因，在包括结直肠癌在内的多种肿瘤细胞中，RECK 呈低表达或不表达，且在肿瘤细胞中其基因启动子区域呈甲基化而失活[1]。此外，RECK 也与肿瘤的侵袭性呈负相关。因此，采用药物干预，提高其表达水平，是治疗结直肠癌的重要思路。本研究旨在探讨木犀草素对结肠癌细胞抑癌基因RECK 表达的影响，并初步探讨其机制。

资料与方法

主要实验材料：人结直肠癌细胞系HCT116 源自美国ATCC。鼠抗人RECK多克隆抗体、RECK 引物由上海生工合成。RNA提取试剂盒、定量PCR试剂盒。DNMT1活性试剂盒，Sp1活性试剂盒。

细胞培养与处理：将HCT116 细胞用DMEM(Hyclone)培养基中，含有10%(V/V)胎牛血清，以及100 U/mL 青霉素G和100 μg/mL 链霉素的培养基中，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。细胞处理前先调整其密度为5×104/mL，随后根据不同的实验目的将细胞接种于96孔板或6孔板中，12～24 h后加入终浓度为5、10和20 μmol/L木犀草素作用不同时间。

Western blot 检测RECk 蛋白表达：用含有蛋白酶抑制剂混合物和PMSF的裂解缓冲液裂解。测定蛋白质浓度后。蛋白经10%～15%SDS-PAGE 分离并转移到PVDF 膜上。室温下用含5%脱脂奶粉封闭膜1 h，然后与一抗在4℃温育过夜。最后将膜与HRP 标记的二抗温育1 h，最后化学发光、显影，并计算灰度值。

定量PCR 检测RECK mRNA 表达：采用Roche LightCycle 480 系统进行实时RT-PCR。RT-PCR 的初始步骤在50℃2 min，随后95℃下进行10 min 后，进入40 个扩增循环：95℃15 s，然后在60℃退火1 min。最后60℃1 min。计算所有样品的Ct值，并计算相对表达量。

DNA 甲基转移酶1 和Sp1 活性分析：获取处理后的HCT116 细胞提取核蛋白，测定其蛋白浓度后，分别测定DNMT1 和Sp1 的活性。该试剂盒上包被有Dnmt 或Sp1 吸附基质，样品中的Dnmt1 或Sp1 结合到基质上，能被特异性的抗体识别，可通过ELISA法测定其吸光度，活性与显色程度呈线性关系。

统计学方法：采用SPSS 统计学软件分析数据，所有结果重复3 次。组间比较采用方差分析后用SNQ 法进行两两比较；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

不同浓度木犀草素上调RECK 蛋白表达：Western blot 结果显示，对照组RECK 的灰度值为(0.12±0.04)，经5、10和20 μmol/L 木犀草素处理后，灰度值分别为(0.22±0.04)、(0.34±0.01)和(0.42±0.02)。与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

不同浓度木犀草素上调RECK mRNA表达：实时定量PCR 结果显示，5、10和20 μmol/L 木犀草素处理后，RECK mRNA 的相对表达量分别为(1.15±0.02)、(1.67±0.03)和(2.68±0.05)，与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

不同浓度木犀草素抑制人DNA 甲基转移酶1(DNMT1)表达：对照组DNMT1活性较高。5、10和20 μmol/L木犀草素处理后，酶活性分别为对照组的(91±3.14)%、(84.6±4.16)%和(75.3±2.61)%。与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

不同浓度木犀草素抑制Sp1 活性：ELISA 方法结果也显示，HCT116 细胞静息状态下Sp1 活性较高。给予不同浓度木犀草素孵育24 h 后，随着木犀草素浓度的增高，Sp1活性逐渐降低。

讨 论

RECK 基因是近年新发现的一个抑癌基因，其主要功能是能抑制肿瘤细胞的侵袭与转移。研究表明，RECK 的表达水平与恶性肿瘤患者的生存率呈明显的正相关。RECK 通常在身体的所有细胞中表达，在细胞外基质(ECM)的生成与降解中起着重要作用。RECK 是基质金属蛋白酶的抑制剂，后者可分解细胞外基质，并能促进新生血管的形成[2]。而ECM 的降解和新血管的动员是肿瘤侵袭与转移的必备条件。若肿瘤在这些功能方面受到抑制，肿瘤将停止生长。因此，RECK 是一种潜在的抑制剂，也是早期临床阶段可用的预后标志物。木犀草素是植物中的一种天然黄酮类化合物。富含木犀草素的蔬菜和水果包括胡萝卜、花椰菜、洋葱叶、欧芹、芹菜、甜椒和菊花。木犀草素具有很强的抗癌、抗炎和抗氧化活性，在许多类型的癌细胞中可以逆转多药耐药(MDR)。它还可以改善各种化疗药物可能引起的细胞毒性[3]。尽管木犀草素有很好的抗癌特性，但它们的确切作用还不清楚。本研究发现，木犀草素不但可上调RECK 的mRNA 和蛋白表达水平，同时也能下调细胞内DNMT1 和核转录因子Sp1 的活性，后者是介导DNA 甲基化的重要分子。木犀草素对甲基化的抑制，能有效改善RECK 的甲基化状态，从而激活并重新诱导RECK 表达，最终发挥对肿瘤细胞的侵袭与转移的抑制作用。在未来的研究中，将对其作用机制开展进一步探讨。

攻读经典 力求实用

中医人读书要广泛涉猎。中医的思想受佛、道两家思想的影响，尤其是佛家的思想。《黄帝内经》包含《素问》《灵枢》两个部分，《灵枢》《素问》都包含八十一篇。《难经》也是八十一篇，这些都是受佛教的影响。佛教认为，人生要度过八十一个关口，《西游记》中唐玄奘也是经历了八十一难才取回了佛教真经。而佛教思想也渗透到了医学、药学的领域，比如君主之官、相傅之官虽然都是外界词汇，但却渗入了中医学说中。

在读经典文献时，不能死记硬背，应该活学活用。“一寸光阴一寸金，寸金难买寸光阴”，要把时间用到研读重要的文献中去。在研读经典的过程中，要注意各个经典的结合，把死书读活，才能有所收获，否则就是浪费时间。除此之外，在读经典时，不能浮光掠影、走马观花的读书，要一字一句地认真研读。

有些人不重视《神农本草经》。《神农本草经》中记载了许多药物性能，但许多人认为它过时了，其实不然，《神农本草经》才是认识药物性能的关键。以人参为例，1957年，笔者在灵岩寺给学生讲《伤寒》《金匮要略》时，讲到了人参汤可生津止渴，而大家平时了解的人参都是温阳的。原来这种止渴的人参是山西党参而非东北人参，这种差异在《神农本草经》中就有记载。如果不读《神农本草经》，就无法了解到这一点。

读《黄帝内经》时，要重点汲取《黄帝内经》的精华部分，先浏览，寻其精华，熟稔于心。但也不能被其束缚住，读时应当安心定神，“进得去，又能出得来”。

《伤寒论》为必读之书，历代单注解《伤寒论》的著作就有六百多本。笔者主张要读原文先不看注解，这样就不会让注解中他人的思想先入为主，影响自己的思考。《伤寒论》在流传、整理及印刷的过程都有可能出现许多错字和张冠李戴现象，给后人学习研究造成困难。又如六经提纲中，太阳病表证与其他疾病有相似之处，然而给温病戴上太阳病的帽子是不合适的。再如书中三阴三阳、六经学说概念历代学者几百年争论不休，浪费几多光阴。而要做的就是辨证施治，力求实用，能够跳出三界外不在五行中，把死书用活。

读书还要注重其实用性。大家要熟练运用经典中的方药，《伤寒论》中112张处方要背得滚瓜烂熟，达到信手拈来的境界，且要注意用药规律和特点。例如甘草，《伤寒论》中写到甘草90%为炙甘草，而《金匮要略》中则用生甘草。如葛根，有解肌发表、升阳举陷、舒经活络、解酒毒的功效，亦可治疗项背强几几，不过应当注意仅在无汗时可用。如党参，可以止渴，然《伤寒论》《金匮要略》中并不是党参一家。如附子，可温理祛寒、温阳，用时要注意是生附子还是熟附子。