肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞(CTC)与D-二聚体、纤维蛋白原及血小板水平的关系研究

潘荣涛

山东省泰山医院肿瘤内科，山东泰安 271000

肺癌是全球癌症死亡的首要原因。据世界卫生组织统计，每年有超过 170万人因肺癌死亡。在中国，肺癌是发病率最高的癌症，2015年新发病例达73万例。据报道，中国68%的肺癌患者在诊断时已属晚期。病发后患者如未能得到及时有效治疗，便会对其生命安全造成威胁。非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常见的类型，约占所有肺癌患者的 85%，其中25%～30%为鳞状细胞癌，50%～65%为非鳞非小细胞肺癌。患者的生存率与诊断时的肿瘤分期和类型高度相关[1]。而凝血系统相关因子，如D-二聚体（D-D）、纤维蛋白原（FIB）及血小板水平（PLT）则能够对肿瘤细胞的发生、发展及转移产生影响[2-3]。因此，临床有必要围绕肺癌患者外周血中CTC与D-D、FIB及PLT的关系开展研究，明确其相互之间的联系。该院就2013年1月—2018年1月收治的100例肺癌患者病例资料开展研究，均检测D-D、FIB及PLT等指标，旨在为明确肺癌患者外周血中CTC与D-D、FIB及PLT的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取该院收治的100例肺癌患者病例资料进行整理分析，纳入标准[4]：①患者均经过医院病理学检查确诊；②研究方案确定并经过医院伦理委员会批准后实施；③患者及其家属均签署知情同意书。排除标准：①合并严重心肾肺等器官疾病者，如器官衰竭等；②合并神经系统疾病，精神状态异常者；③合并血栓性疾病及凝血功能疾病；④研究前使用激素或短期内应用抗凝、止血药物者；⑤参与其他研究者。100例患者中，男性58例，女42例，年龄 40～75岁，平均（57.4±1.4）岁；癌症类型：鳞癌 45 例、腺癌 32 例、小细胞肺癌23例；采用国际肺癌相关标准进行TNM分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期16例、Ⅲ期35例、Ⅳ期35例。

1.2 方法

D-D、FIB检测仪器均为法国STAGO全自动血凝仪急性检测，试剂则采用配套试剂；PLT水平检测使用迈瑞BC6008全自动血细胞分析仪及其配套试剂进行检测；采集患者清晨空腹静脉血，观察并检测外周血中D-D、FIB及PLT水平，并采用免疫磁珠阴性分离及免疫细胞化学染色方法检测CTC的表达，进一步分析CTC与D-D、FIB及PLT水平与肺癌患者临床病理特征的关系。具体操作如下：将血液与淋巴细胞分离液体恢复温度18℃～25℃，取7.5 mL抗凝血与7.5 mL磷酸盐缓冲液，在50 mL的离心管中充分混匀后，缓慢贴壁加入另一个装有15 mL淋巴细胞分离液的分离管中，于正常室温下400×g离心30 min。吸取环状乳白色单个核细胞层，加入5倍体积的PBS混匀，于室温下300×g离心15 min，抽取上清，冲洗2遍后将细胞沉淀，重悬与80 μL磁珠缓冲液中，加入由德国Miltenyi Biotec公司成长的CD45抗体20 μL，轻轻混匀后置入4℃冰箱中孵育15 min，后加入20倍体积的磁珠缓冲液，室温下300×g离心15 min，弃上清，加入500 μL缓冲液重悬细胞，重复2遍，收集从分流柱下流出的液体，后离心10 min，将沉淀部分均匀涂抹于防脱载玻片，室温下风干；4%多聚甲醛固定10 min，1×PBS液洗涤5 min，加入由美国Cell Signaling公司生产的鼠抗广谱细胞角蛋白，保存于4℃冰箱中，孵育20 min，PBS浸洗，二氨基联苯胺显色，后进行仔细观察。

1.3 结果判定

D-D正常范围为0～0.55 mg/L、FIB正常范围为1.8～3.5 g/L、PLT 水平正常范围为 （125～350）×109/L。CTC阳性标准：细胞呈圆形、椭圆或长形，长径＞10 um，光镜下可见完整细胞心态及细胞核；有完整的细胞膜，Pan-CK染色阳性，细胞质呈黑色或褐色。有1～2名实验人员在光镜下仔细观察细胞显色情况[5]。

1.4 统计方法

该次研究在处理数据时采取SPSS 20.0统计学软件。计量数据以均数t标准差（x±s）表示，采取独立配对t检验；计数数据以百分比（%）表示，采取χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-D、FIB与PLT水平表达情况

100例肺癌患者D-D、FIB及PLT水平平均分别为（1.74±2.06）mg/L、（3.53±1.42）g/L、（311.25±135.69）×109/L，D-D、FIB 水平、PLT水平均与肺癌患者远处转移情况有关差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表 1 D-D、FIB 与PLT水平表达情况（x±s）

2.2 外周血中CTC与D-D、FIB及PLT水平之间的关系

100例肺癌患者中，CTC阳性55例、CTC阴性45例，CTC阳性患者 D-D、FIB及 PLT水平分别为（2.32±2.42）mg/L、（3.75±1.45）g/L、（337.69±130.15）×109/L，CTC阴性患者D-D、FIB及PLT水平则分别为（0.94±1.03）mg/L、（3.12±1.24）g/L、（229.35±128.66）×109/L， 差异有统计学意义 （t=3.568、2.305、4.163，P=0.000、0.012、0.000）。

2.3 肺癌患者的远处转移情况与CTC表达的关系

有远处转移患者CTC阳性率92.86%（29/35），无远处转移患者CTC阳性率53.85%（35/65），差异有统计学意义（χ2=7.099，P=0.008）。

3 讨论

肺癌是临床常见疾病，由吸烟、职业环境接触、电离辐射、肺部慢性感染等内外在因素导致，具有发病率高、死亡率高等特点[6]。病发后，患者可出现咳嗽、痰中带血、咯血、胸痛、胸闷、气急等临床表现，部分患者可伴随肺炎、肺不张、恶性胸腔积液等疾病，严重影响机体生活质量及生命健康[7]。据临床资料[8-9]记载，肺癌患者中有近90%死亡是由肿瘤转移导致，故而部分学者认为有效控制肿瘤转移可稳定患者病情，为后续治疗建立良好基础。而CTC则是癌症细胞形成远处转移病灶的关键，故而有必要对其开展相关研究，进一步明确CTC与癌症患者之间的关系，判断是否能够将其作为检测肿瘤治疗方案制定及评估疗效的重要指标。

该研究中，存在远处转移患者中，CTC阳性率为92.86%，明显高于无转移患者的53.85%，对比差异有统计学意义（P＜0.05）。 而患者D-D、FIB及PLT水平等指标在有无远处转移的条件下均差异明显，可通过观察D-D、FIB及PLT水平等指标来对患者病情及转移情况进行评判。在临床中D-D指标作为交联纤维蛋白经纤溶酶分解后的最终末产物，是机体内部高凝状态及纤溶系统亢进的重要分子标志物，一旦出现升高则表明继发性纤溶亢进。FIB则为一种在肝内合成的急性期反应蛋白，是血浆含量最高的凝血因子，也是临床中各内科疾病的重要检测指标。据了解[10]，肿瘤细胞可分泌PLT凝集活性因子，并促进PLT在肿瘤细胞表面黏附、聚集，同时释放出PLT源性生长因子，能够促使肿瘤在转移部位生长。该研究结果提示，CTC阳性患者D-D、FIB及PLT水平分别为 （2.32±2.42）mg/L、（3.75±1.45）g/L、（337.69±130.15）×109/L，CTC阴性患者D-D、FIB及PLT水平则分别为（0.94±1.03）mg/L、（3.12±1.24）g/L、（229.35±128.66）×109/L，证实D-D、FIB及PLT水平等指标均可参与并促进CTC的转移和生长；且通过观察临床其他学者围绕肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞(CTC)与D-二聚体、纤维蛋白原及血小板水平的关系开展研究结果来看，其结果与该研究结果相同，均认为D-D、FIB及PLT水平等治疗参与并促进CTC的转移和生长。但是由于目前临床针对上述理论开展研究相对较少，其相互之间的作用及影响仍旧有待进一步研究查证。

综上所述，针对肺癌患者实施预防性抗凝治疗能够提高治疗效果，通过改善D-D、FIB及PLT水平等指标，可减少肿瘤的复发、转移，来实现减缓肿瘤进展的目的，使患者生存时间得以延长。