HPLC 测定（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐中有关物质

梅 妙，陈明煌（.杭州珠联医药科技有限公司，浙江 杭州 3005；.杭州民生滨江制药有限公司，浙江 杭州 3005）

阿巴卡韦是葛兰素史克公司推出的非常重要的抗HIV药物，它不但是核苷类逆转录酶抑制剂中非常重要的一种药物，而且也是进行鸡尾酒疗法不可或缺的一种重要组成成分，具有非常广阔的市场空间。

（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐是合成阿巴卡韦的关键中间体，本研究根据阿巴卡韦合成工艺路线，确定（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐原料可能存在的有关物质（1R，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐（杂质 A），（1R，4S）-2-乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮（杂质 B）和 N-（（1R，4S）-4-（羟甲基）环戊-2-烯基）乙酰胺（杂质C），结构式见图1。为更好地控制（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐的有关物质，本实验采用异硫氰酸苯酯将样品及其有关物质进行柱前衍生 （（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐和杂质A与异硫氰酸苯酯分别反应生成相应衍生物，杂质B与甲醇反应，具体衍生结果见图2），再使用HPLC梯度洗脱，重点对（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐的有关杂质进行相关研究。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪；XS105DU型梅特勒电子天平。

图1 （1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐及杂质A～C的结构式

图2 衍生后结构式及杂质B反应后结构式

（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐（对照品，批号：130801，纯度：99.35%）、（1R，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐（杂质A对照品，批号：140115，纯度：97.96%）、（1R，4S）-2-乙酰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮（杂质B对照品， 批号：131108，纯度：97.39%）、N-（（1R，4S）-4-（羟甲基）环戊-2-烯基）乙酰胺（杂质 C 对照品，批号：131203，纯度：95.86%）均由浙江九洲药物有限公司提供，（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐 （供试品，批号：131201，131202，131203）由上海贝美医药科技有限公司提供；乙腈，甲醇，三乙胺和异硫氰酸苯酯均为色谱级，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 各储备溶液的配制

2.1.1.1 衍生化试剂

衍生化试剂（1）：1 mol/L三乙胺乙腈溶液：取三乙胺溶液3.5 mL，加入25.0 mL容量瓶，用乙腈稀释。

衍生化试剂 （2）：0.05 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液 ：取异硫氰酸苯酯（PITC）150μL到25.0 mL容量瓶中，用乙腈稀释（此溶液须临用现配）。

稀释剂：甲醇。

2.1.1.2 对照储备溶液

（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐对照品储备液：精密称取 30 mg （1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐（130801）对照品，置于10.0 mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，摇匀，即得（3000 μg/mL）。

按相同操作可得杂质A储备液 （杂质A（140115） 对照品精密称取 45 mg，4500 μg/mL）、杂质B储备液（杂质B（131108）对照品精密称取90 mg，9000μg/mL）、 杂质 C储备液 （杂质 C（131203）对照品精密称取 90 mg，9000 μg/mL）。

2.1.1.3 衍生溶液储备液

（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐衍生溶液储备液：精密量取 1.0 mL（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐对照品储备液置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化试剂（1），振荡混匀；再加入 1 mL 衍生化试剂（2），室温静置反应2 h后，用稀释剂定容至刻度，即得，记为A溶液（300μg/mL）。

同理取杂质A储备液，杂质B储备液，杂质C储备液各1.0 mL分别置于三个容量瓶中进行衍生，得杂质A衍生溶液储备液，记为B溶液（450μg/mL），杂质B衍生溶液储备液，记为C溶液（900μg/mL）和杂质C衍生溶液储备液，记为D溶液（900 μg/mL）。

杂质衍生溶液储备液：分别从A、B、C、D溶液精密量取1.0 mL置于同一100.0 mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，即得，记为E溶液。

2.1.1.4 QL衍生溶液储备液：

（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐QL衍生溶液储备液：将A溶液先用稀释剂稀释100倍，再精密量取此溶液1.7 mL至10.0 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐QL衍生溶液储备液，记为F溶液。

按相同操作得杂质A QL衍生溶液储备液，记为G溶液（B溶液稀释100倍后，取1.0 mL）；杂质B QL衍生溶液储备液，记为H溶液（C溶液稀释100倍后，取1.7 mL）；杂质C QL衍生溶液储备液，记为Ⅰ溶液 （D溶液稀释100倍后，取2.0 mL）。

2.1.2 系统适用性溶液的配制

精密量取E溶液1.0 mL置于10.0 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；（其中（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐浓度为 0.3μg/mL，杂质 A浓度为0.45μg/mL，杂质B和杂质C浓度均为0.9μg/mL，分别相当于供试衍生溶液的0.1%，0.15%，0.3%）。

2.1.3 线性溶液

精密量取 E 溶液 0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、3.0 mL 分别置于不同 10.0 mL 容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得50%、80%、100%、120%、150%、300%线性溶液。

2.1.4 QL衍生溶液的配制

分别精密量取F，G，H，Ⅰ溶液各1.0 mL置于同一10.0 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.5 空白衍生溶液的配制

精密量取1 mL稀释剂置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化试剂（1），振荡混匀；再加入1 mL衍生化试剂（2），室温静置反应2 h后，用稀释剂定容至刻度即得供试品空白衍生溶液；此溶液稀释1000倍即得系统适用性空白衍生溶液。

2.1.6 供试衍生溶液的配制

精密称取 30 mg ABA20（131201）供试品，置于10.0 mL容量瓶中，用稀释剂溶解并定容至刻度，此为供试品储备溶液；精密量取1 mL上述溶液置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化试剂（1），振荡混匀；再加入 1 mL 衍生化试剂（2），室温静置反应2 h后，用稀释剂定容至刻度，即得供试品衍生溶液；（300μg/mL）

2.1.7 加标供试衍生溶液的配制

精密量取供试品储备溶液1 mL，置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化试剂（1），振荡混匀；再加入1 mL衍生化试剂（2），室温静置反应2 h后，再精密量取E溶液1.0 mL于同一10.0 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.8 回收率溶液

精密量取供试品储备溶液1 mL，置于10.0 mL容量瓶中，先加入1 mL衍生化试剂（1），振荡混匀；再加入1 mL衍生化试剂（2），室温静置反应2 h后，再精密量取 F，G，H，Ⅰ溶液各 1.0 mL于同一10.0 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得样品+QL溶液；同理可得样品+100%溶液（精密量取E溶液1.0 mL）和样品+150%溶液（精密量取E溶液1.5 mL）。

2.2 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱为AgilentEclipseXDB-C18柱（250 mm×4.6 mm ×5.0 μm）； 流 动 相 A 为 10 mmol/L KH2PO4（称取2.72 g KH2PO4置于2 L烧杯中，加纯化水溶解并慢慢摇匀，直至2.0 L，过滤，超声即可），流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：B变化：0～5 min，8%；5～8 min，8%→25%；8～22 min，25%→27%；22～27 min，27%→70%；27～35 min，70%；35～35.1 min，70%→8%；35.1～45 min，8%；柱温为25℃，样品室温度为5℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为UV 204 nm，进样量为10μL，洗针溶剂为甲醇。

取系统适用性溶液和系统适用性空白衍生溶液（配制见“2.1.2”和“2.1.5”）进样检测，记录色谱图，结果表明，杂质A，杂质B，杂质C各杂质与主成分（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐有较好的分离度。结果见图3。

图3 系统适用性溶液色谱图

2.3 专属性实验

通过比较空白溶液（有供试品空白衍生溶液和系统适用性空白衍生溶液，配制见“2.1.5”）、杂质对照衍生溶液 （即系统适用性溶液，配制见“2.1.2”）、供试衍生溶液（配制见“2.1.6”）和加标供试衍生溶液（配制见“2.1.8”），确定在系统适用性实验中，该色谱条件专属性强，各杂质与主成分分离度良好，在供试品实验中，供试衍生空白溶液中RT≈11.2 min左右的峰对杂质B其中一个峰（杂质B’）有干扰，须扣除相应浓度的空白峰峰面积，其他杂质无干扰，且经DAD检测器检测，主峰纯度良好（主峰纯度均大于峰纯度阈值990.0），故整体而言，该方法专属性较强。结果见图4。

2.4 线性实验

按确认的验证范围，以100%杂质对照衍生溶液浓度为基础，用稀释剂为溶剂，分别配制QL、50%、80%、100%、120%、150%、300%线性浓度系列（溶液配制见“2.1.3”和“2.1.4”），作为线性测定溶液。每个溶液配制1份，QL进样6针，其他每份进样1针，记录色谱图。以峰面积对浓度得到线性方程和相关系数r2。要求测得各溶液的相关系数r2不得小于0.99。测得结果详见表1。

表1 线性实验结果

由以上数据可知，杂质A、杂质B和杂质C及未知杂质的线性满足要求。

2.5 稳定性实验

按“2.1”项下配制的杂质对照衍生溶液（即系统适用性溶液，见“2.1.2”），（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐供试衍生溶液 （见“2.1.6”）、及加标供试衍生溶液（见“2.1.8”）各 1 份，冷藏条件下，分别于0 h、14 h、25 h取样测定，以0 h测得各组分峰面积为基准，计算在不同测定时间测得各组分峰面积的回收率，测得结果详见表2。

表2 稳定性实验结果

图4 专属性实验色谱图

由以上数据得，供试衍生溶液、杂质对照衍生溶液及加标供试衍生溶液在冷藏条件下存放25 h 后， 各杂质及 （1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐峰面积的回收率均在90%～110%范围内（计算上杂质B已扣除空白的干扰），同时比较在不同时间测得色谱图，没有降解峰出现，也没有峰消失。说明供试衍生溶液、杂质对照衍生溶液及加标供试衍生溶液在冷藏条件下可以稳定存放25 h。

2.6 定量限及检测限

各物质的定量限即为其线性范围的最低点。取（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐和各杂质衍生储备液适量逐级稀释，配成一系列浓度的混合溶液，分别进样，当 S/N≈10时，（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐、杂质B的浓度相当于杂质对照衍生溶液的17%，杂质A的浓度相当于杂质对照衍生溶液的10%，杂质C的浓度相当于杂质对照衍生溶液的20%（样品配制见“2.1.1”和“2.1.4”）。 平行进样定量限溶液 6 针，计算（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐、杂质A、杂质B、杂质C峰面积的平均值和相对标准偏差RSD，要求RSD不得大于10%。检测限=1/3定量限，由定量限计算得到，测得结果详见表3。

表3 定量限及检测限实验结果

2.7 准确度实验

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。本实验设计了QL、100%和150%三个不同浓度测试点，配制过程见“2.1.8”回收率溶液的配制，每个浓度点制备1份。以供试衍生溶液 （配制过程见“2.1.6”）为基础，计算各杂质在各测试点的回收率平均值，测得结果详见表4。

表4 准确度实验结果

从表4可以得知，在QL～150%的设定范围内，结果符合50%～150%要求，说明该分析方法有较好的准确度。

2.8 精密度实验

分别配制6份100%加标供试衍生溶液和1份供试衍生溶液（配制过程见“2.1.6”和“2.1.8”），以供试衍生溶液为基础计算6份100%加标供试衍生溶液中杂质A、杂质B、杂质C峰面积的回收率，并用相对标准偏差RSD评价测得回收率，测得杂质A、杂质B和杂质C回收率的RSD分别为0.74%、5.75%、3.26%，均满足RSD不得大于10%的要求，重复性良好。

2.9 样品测定

分别称取 3 批 （1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐样品适量，按“2.1.6”进行样品衍生配制，作为供试品溶液；，再按“2.1.2”配制对照溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，按外标法计算各有关物质的含量。结果见表5。

表5 样品有关物质测定结果

3 讨论

3.1 稀释剂的选择

根据（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐和各杂质的溶解性，同时结合衍生条件所使用的溶剂，首先尝试了乙腈，但溶解性没有甲醇好，储备液无法完全溶解，故放弃，DMF和DMSO在衍生后测定会有较大干扰，结合种种，最终选择甲醇。

3.2 衍生溶剂量的确定

查阅相关衍生文献，再结合衍生最好在3 h内完成的考虑，尝试了（1）0.03 mol/L PITC乙腈溶液，常温和 50℃各衍生 1 h，2 h，3 h；（2）0.04 mol/L PITC乙腈溶液，常温和25℃各衍生1 h，2 h，3 h；（3）0.05 mol/L PITC乙腈溶液，常温和25℃衍生1 h，2 h，3 h 等条件的删选，后发现：（1）不管 25 ℃还是50℃，虽加速了衍生，但也破坏了其中有些杂质，使总杂偏大，故选择常温衍生；（2）常温衍生下，0.03 mol/L和0.04 mol/L的PITC乙腈溶液3 h内均不能使样品完全衍生，使用0.05 mol/L的PITC乙腈溶液，在1 h时，样品未衍生完全，对比2 h和3 h，峰面积基本稳定，故推断样品2 h可完全衍生，综合所有，最终选择0.05 mol/L的PITC乙腈溶液常温衍生2 h。

3.3 注意事项

在实验中，由供试品空白衍生溶液谱图中得，随着时间的延长，原有RT≈11.2 min小峰的峰面积在增大，对杂质B’的干扰会变大，且杂质B和杂质C易受碱性条件的影响，为保证实验的准确性，故0.05 mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）乙腈溶液须临用现配，且控制样品池温度在5℃，样品检测及时完成。

3.4 杂质的确定

根据（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐合成阿巴卡韦的工艺路线，确定（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐中主要包括杂质A、杂质B、杂质C和未知杂质，衍生后还包括衍生杂质，通过LC-MS的结构确证及相关杂质的制备，准确确定了存在的各种杂质，该方法准确、可靠，为阿巴卡韦中间体-（1S，4R）-（4-氨基环戊-2-烯基）甲醇盐酸盐提供了切实可行的质控方法。