针药法对高脂血症模型大鼠血管保护作用对比研究*

周海纯，郭蕊珠 ,王艳丽，赵海深，孔德凤，蔡国锋

(1.黑龙江中医药大学第二临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨市急救中心，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江护理高等专科学校,黑龙江 哈尔滨 150301；4.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040)

高脂血症是动脉硬化主要危险因素之一，同时是导致脑梗死、脑出血等脑血管疾病的主要诱发因素[1]，在我国随着生活方式及饮食结构的转变，该病发病率逐年上升，并且趋于年轻化，目前国内医药市场对于高脂血症的治疗尚缺乏特效药物，临床治疗以西药，如羟甲戊二酰辅酶A还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、烟酸类调脂药、胆固醇合成抑制剂和胆汁酸螯合剂等药物为主，长期服用肝肾损害极大。北方地区由于生活区域气候寒冷，饮食以肉食、酒食为主，高脂血症频发，历代医生在长期与疾病的斗争中，协定处方调脂饮经过大量研究，临床疗效确切，目前是临床治疗高脂血症及预防心脑血管疾病的重要手段[2-3]。在临床应用广泛，治疗效果显著，同时在长期临床工作中发现微针扶正祛邪。实则祛痰饮、通脉络，虚则补肝肾亏损，调脾胃。针药并用，相辅相成，增加疗效。故采取此次实验研究，奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择健康成年SPF级SD大鼠雌雄各半，共计120只，大鼠体重分布为(200±20)g，由延边大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK (吉)2012-0009。实验动物饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，清洁级，控制适宜温度，保持适合湿度。

1.2 试验药品

1.2.1 调脂饮组成 调脂饮为新疆药王王仁老先生自拟经验方，药物由丹参、荷叶各15 g,山楂35 g,甘草15 g,何首乌10 g、枸杞、菊花、虎杖、蝉蜕各15 g,共9味药物组成。

1.2.2 调脂饮功效 主要治疗高脂血症，功效为改善血脂水平、调整脂质代谢。

1.2.3 调脂饮颗粒制备 第一步：浸膏制备。以上共同煎煮2次，2 h/次，将滤液浓缩，制成浸膏，控制相对密度1.10～1.15，控制温度60℃。

第二步：稠膏制备。将浸膏冷却，达到室温后选择乙醇溶液搅拌均匀，混合物质要求乙醇百分比达到50%，16 h后抽取混合物质上清液，并将乙醇回收，制成稠膏，控制相对密度1.20～1.25，控制温度60℃[4]。

第三步：颗粒制备。将上述制备的稠膏，分别混合固定比例的蔗糖、糊精搅拌均匀，风干处理，颗粒制备完成，由黑龙江中医药大学制剂室制备。储存，灌胃使用。

1.3 试验仪器

日立7180型全自动生化分析仪；TGL-19台式高速冷冻离心机；电热恒温水浴箱；MP2000D 电子天平。

1.4 试验造模及分组

预实验采取血清记录实验前基础值;华佗牌针灸针(0.3×40 mm,苏州鲁跃医疗器械有限公司)，108只SPF级SD大鼠高脂饲料喂养，喂养时间持续45天，检测TC、TG、HDL-C、LDL-C，确定造模成功大鼠，选择60只随机分为模型组、对照组、针药组，共3组。

1.5 干预方法

模型组：灌胃，灌胃等体积标准蒸馏水。1次/日。

对照组: 调脂饮低剂量，颗粒稀释，灌胃标准0.45 g·kg，1次/日。

针药组：调脂饮，颗粒稀释，灌胃标准0.45 g·kg，1次/日。微针取穴：丰隆、足三里、中脘、脾俞;微针刺法：捻转进针，得气后留针20 min，每10 min行针1次，1次/日。

1.6 调脂饮急性毒理试验

开展高剂量的调脂饮急性毒理试验，检验调脂饮方剂的安全性。

1.7 荧光定量PCR检测

引物设计与常规 PCR扩增根据GenBank已发表的大鼠Hes5、Mash1、Ngn1、Ngn2序列和β-Actin的序列，应用Premier5. 0设计5对引物。

上游引物 Hes1-F 5′-ATGCCAGCTGATATTGG-3′;下游引物 Hes1-R 5′-GGCGGGGTGCGCCTGCCCGGGG-3′。

引物设计与常规 PCR扩增根据GenBank 已发表的大鼠Hes1序列和β- actin的序列，应用 Premier5.0设计2对引物，PCR产物长度分别为480 bp(目的基因的片段长度)和640 bp(内参基因的片段长度)。上游引物β-Actin-F 5′-CGTTGACATCCGTAGACCTC-3′;下游引物β-Actin-R 5′-GGGAGGGTGAGGGACTTCCTGT-3′。

PCR反应采用50 μL 体系:10×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、Taq酶1 μL、模板2 μL、ddH2O 36 μL。

具体步骤如下：第一步骤：选择95℃预变性5 min;第二步骤：选择95℃再次变性30 s；第三步骤：选择55℃退火持续30 s； 第四步骤：选择72℃延伸持续45 s； 第五步骤：选择30个循环；第六步骤：选择72℃延伸持续10 min。第七步骤：选择1%琼脂糖凝胶进行电泳实验用来检测完成的PCR产物。

1.8 总RNA质量检测

细胞的总RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC处理的ddH2O中。采用琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整度，采用分光光度法测定RNA的浓度和纯度。实验中所得样品的OD260/OD280值均在1.8～2.0范围之内，并根据OD260计算浓度，调整RNA的浓度为500 ng/μL；琼脂糖凝胶电泳结果表示，28S rRNA与18S rRNA的亮度比值约为2∶1，说明实验中所抽提得到的总RNA质量较好，无降解，可以满足后续实验的要求。见图1。

表1 对血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的影响

注：与模型组比较,AP<0.05,BP<0.01,CP>0.05;与对照组比较,**P<0.05,***P<0.01,*P>0.05。

图1 总RNA的质量检测

1.9 统计分析

2 结果

2.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C比较

高脂血症大鼠模型针药组大鼠与对照组，TC、TG、HDL-C、LDL-C比较(P均<0.01)，提示造模成功。

表1显示：高脂血症大鼠经过单纯给药与针药治疗后，TC、TG含量均有明显改善，与模型组相比，均具有极显著差异(P<0.01)。高脂血症大鼠经过针药组和对照组治疗均有效，但针药组与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。因此针药组和对照组治疗高脂血症大鼠均有效。

针药组、对照组与模型组相比，HDL-C含量均升高趋势;对照组HDL-C含量未能达到正常水平。而针药组效果显著，与对照组比较(P<0.05)，说明针药组降低血清中HDL-C含量的效果最佳。

针药组、对照组与模型组相比，LDL-C含量均降低趋势;对照组LDL-C含量未能达到正常水平。而针药组效果显著，与对照组比较(P<0.05)，说明针药组与对照组比较针药组降低血清中LDL-C含量的效果最佳。

2.2 Hes5 mRNA结果

Hes5 mRNA提示血脂代谢产生血管内皮破坏抑制因子，Hes5 mRNA相对表达结果升高提示血管保护修复机制增强，结果可见针药组、对照组与模型组相比Hes5 mRNA相对表达结果均为升高趋势(P<0.01);并且时间越延长Hes5 mRNA相对表达结果升高趋势越明显。针药组和对照组比较针药组Hes5 mRNA相对表达结果的效果最佳，并且连续28天效果最佳。因此得出结论针药组在治疗28天时对血管保护修复机制活性最强。见表2～3、图2。

表2 Hes5和β-Actin引物设计

2.3 Mash1 mRNA结果

Mash1 mRNA提示血脂代谢产生血管内皮破坏因子，所以Mash1 mRNA相对表达结果减低提示血管保护修复机制增强，针药组、对照组与模型组相比Mash1 mRNA相对表达结果均为减低趋势(P<0.01);并且时间越延长Mash1 mRNA相对表达结果均表现减低趋势越明显。针药组和对照组比较针药组Mash1 mRNA相对表达结果的效果最佳，并且连续28天效果最佳。因此得出结论针药组在治疗28天时对血管保护修复机制活性最强。见表4～5、图3。

图2 Hes5 mRNA普通PCR电泳图

表3 Hes5 mRNA相对表达结果

表4 Mash1和β-Actin引物设计

表5 Mash1 mRNA相对表达结果

图3 Mash1 mRNA普通PCR电泳图

2.4 调脂饮急性毒理试验结果

因调脂饮预试验未能检测LD5Q，因此仅完成最大给药量实验。按照最大可灌浓度及最大灌胃容量给药[5-7]，未见实验动物异常及死亡，实验验证调脂饮对于小鼠的最大耐受量≥150 g/kg， 此剂量临床成人标准量的454倍以上。依据急性毒性分级标准，认为该受试药物对受试动物无急性毒性。

3 讨论

高脂血症中医并没有明确病名，可将其归属为中医的“痰饮”“瘀血”等范畴[8]。研究表明，针灸、中药治疗高脂血症均有良好的效果，并认为痰浊贯穿该病的始终，一方面痰饮是高脂血症的病理产物，另一方面痰饮又是导致高脂血症的病理因素[9-10]。痰饮的形成与人体的津液代谢相关，涉及到脾、肾、肝等脏腑，其中以脾脏功能失常为主，脾失健运则影响水谷精微与水液运化、输布，使水谷津液不能转化为人体所需要的气血津液，这些物质聚而成痰浊，危害人体健康，与《景岳全书》中所记载的“痰涎本皆气血，水谷津液化得其正则为津血，化失其正，则为痰浊”不谋而合。瘀血也是高脂血症的另一重要因素，与痰饮成为高血脂的两大病理因素[11]。高脂血症其中医病机为本虚标实，本虚以脾、肾虚为主，标实以瘀血、痰湿为主。因此本次选择针刺、中药自拟方以健脾化痰、活血化瘀、补益脾肾为基本治则。

上个世纪90年代，就有研究表明针灸可以通过刺激交感神经来促进激素的分泌，例如肾上腺素等，使细胞膜上腺苷酸环化酶激活，增加细胞内环磷酸腺苷，以促进脂肪分解，达到降脂的目的[12]。丰隆为胃经之络穴,通脾胃两经，针刺此穴可调节脾胃脏腑功能，促进水谷精微与津液的正常运化与输布，同时该穴为治痰饮之要穴，《玉龙歌》中就有关于丰隆穴治疗痰饮的记载,书中曰:“痰多宜向丰隆寻”。 足三里为胃经之合穴，同时又为人体保健之要穴，临床应用广泛，具有健脾和胃、化痰通络之功。国内学者认为[13]“血瘀致病，三里疗之”，通过对足三里穴位的针刺，可补中升阳，阳升则气行，气行以促进人体血液的运行，血行则瘀血自消。动物实验证明[14]，通过对高脂血症新西兰兔给予足三里穴、丰隆穴电针针刺，可以降低血清总胆固醇水平，进而调节血脂。中脘穴位于任脉之上，既为胃经之募穴，又为腑会，因此可治一切腑病，尤擅胃腑之疾患，脾俞为脾经之俞穴，益脾胃、养气血、化湿浊；脾俞处于脾脏气血注输之地，可主脾病，具有健脾除湿、益气通血之功。中脘与脾俞相互为用，为俞募配穴，两者能更好的健脾和胃除湿、补益气血。国内研究表明[15]，对俞募穴进行穴位埋线可降低高血脂患者的血脂水平。中药选择山楂、丹参、虎杖、荷叶以活血化瘀；以何首乌、枸杞补肝肾；以菊花、蝉蜕以清肝，肝清则舒，可促进瘀血的消散与痰饮的驱逐；甘草补脾兼调和诸药，诸药与针灸合用共达补虚化痰、活血祛瘀之功效。

查阅大量参考文献高脂饲料饲喂造模，成功率很高，同时与人发病机制相似[16-18]。SD大鼠作为模型动物，能保证实验的可操作性;血脂四项(TC、TG、LDL-C、HDL-C)是检测血脂水平的公认标准[19],能保证实验的准确性；而单存给药是协定处方药，能保证实验阳性对照组的可靠参考性[20-21]。实验显示各治疗均能降低TC、TG和LDL-C水平，增高HDL-C水平，微针与高剂量治疗作用效果最佳。目前利用针药法治疗高脂血症的临床及试验研究相对较少，因此本次研究在未来针对高脂血症的治疗上有重要的意义。在实验过程中遇到了诸多问题，方剂研究涉及的是一个典型的多因素多水平问题，笔者对药物组合治疗方案进行优选，筛选对比研究，其作用已经十分清晰，所以本研究有设立调脂饮为对照组重复验证其作用，既具有临床观察证实，又存在现代药理研究证据，实验观察此方法还可以调节谷氨酸、天门冬氨酸及GA含量的异常升高，起到脑保护的作用。然而中药方剂受各种因素影响，比如方剂中各种药物的配伍剂量、君臣佐使的配伍方法均存在着非常复杂的交互作用，方剂给药途径有口服灌肠等，各种给药方法也会对药物的吸收存在影响，中医时令服药的给药时间，理论上也会影响药物的治疗效果，综上这些作用影响存在协同效应或拮抗效应[22-24]。此次试验为了验证临床观察结果，笔者只是在宏观评分及微观分子RNA水平进行了量化比较，仍然没有足够基础进行定量配伍剂量及君臣佐使的配伍方法分析，没有足够基础对药物间交互作用的性质(协同效应或拮抗效应)进行分析，未对中药组合之间的作用机制进行深入探讨。只是依据临床经验在临床常用剂量基础上调整，所以本研究只是为了改善高脂血症的临床疗效，采用的一次初步研究，在今后的系列研究中，笔者将对本次未完成的内容进行更深一步的研究，期待得出更加系统的各种基本数据和信息，为在临床的使用贡献一份力量。