4个抗稻瘟病基因在籼稻资源中的分布

李培江，张选明，沙志鸿，刘志奇，周 凯，严洪庆，顾朝军

(陕西省水稻研究所，陕西 汉中 723000)

【研究意义】水稻(Oryzasativa)是我国重要的粮食作物之一，由子囊真菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病已成为水稻高产稳产的严重阻碍，其危害面积与危害程度日趋严重[1-2]。实践证明，选育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法，而鉴定和筛选品种资源的抗瘟基因型是选育抗性品种的首要前提[3]。【前人研究进展】随着分子标记技术的发展，越来越多的国内外学者对抗稻瘟病基因做出报道，截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因。其中，Pita、Pib、Piz-t,、Pi9等24个基因已被成功克隆，并开发出了特异性分子标记[4]。Pi-ta和Pib是最早分别从日本抗性材料BL-1、Tetep中克隆的抗稻瘟病基因，王忠华等利用抗稻瘟病基因Pita自身序列分别设计出能扩增抗病等位基因Pita的特异性引物YL155/YL87，和感病等位基因Pita的特异性引物YL183/YL87[5-6]。Pi-b基因位于水稻第2 染色体长臂近末端区域，Robert等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列设计出能扩增抗病等位基因Pib的特异性引物Pibdom[7]。刘洋等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列设计出能扩增感病等位基因Pib的特异性引物Lys145[8]。Pi-9是已克隆的抗谱最广的基因，也是一个具有NBS-LRR 结构的抗性基因，它与Pi-2、Pi-zt、Pi-gm是复等位基因，同Pi-2和Pi-zt仅有8个氨基酸的差异，并找到了与该基因紧密连锁的分子标记PB8[9]。戴小军等利用抗稻瘟病基因Pi-9自身序列设计特异性显性标记PB8[10]。华丽霞等通过序列比对，开发出Pi-zt特异性显性分子标记Pizt-PA[11]。利用这些标记可以快速准确地从水稻资源中鉴定并筛选含有抗性基因Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt的材料。【本研究切入点】本研究利用Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt基因的特异性分子标记对汉中地区73份材料进行抗瘟基因型检测，鉴定其抗性基因型背景，初步建立抗性基因数据库，减少抗病育种的盲目性，提高育种效率。【拟解决的关键问题】为抗稻瘟病基因分子辅助聚合育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

汉中市农业科学研究所现存和外引的73份水稻材料，材料的名称和类型见表2。

1.2 菌株来源及接种调查

室内抗谱选用的菌株均采自自住栽培品种，主要来源于汉中高发稻瘟病区域。根据最近几年稻瘟病菌生理小种的致病性测定情况选出的代表性菌株，所有菌株均保存于汉中市农业科学研究所植保室。菌株的培养、活化、繁殖均按照常规方法，选取浓度适中的孢子悬浮液进行人工喷雾接种，接种1周后进行调查。病级调查按照国际水稻所稻瘟病圃苗瘟分级标准进行，0～3级为抗，4～9级为感。

1.3 水稻基因组DNA提取和PCR扩增

采集分蘖盛期的试验材料叶片，用CTAB法提取全基因组DNA。PCR扩增体系为20 μl：2 μl 10× buffer，2 μl DNA，2 μl dNTP，1 μl正反引物，0.5 μl MgCl2，0.5 μlTaq酶，11 μl蒸馏水，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃45 s，扩增重复34次，72 ℃延伸1 min。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳检测，紫外灯下观察和检测。为保证实验的可靠性，每个DNA 样品重复3次。

1.4 引物选择

利用Pi-ta基因特异性分子标记YL155/YL187对供试材料进行检测，以能扩增出1042 bp目标片段的为含有Pi-ta基因；利用Pi-9基因特异性分子标记PB8对供试材料进行检测，以能扩增出500 bp目标片段的为含有Pi-9基因；利用Pi-b基因特异性分子标记Pi-bdomF/Pi-bdomR对供试材料进行检测，以能扩增出365 bp目标片段的为含有Pi-b基因；利用Pi-zt基因特异性分子标记对供试材料进行检测，以能扩增出176 bp目标片段的为含有Pi-zt基因。用于PCR扩增反应的引物名称、序列和扩增片段预期大小(表1)。

2 结果与分析

2.1 4个稻瘟病抗性基因分子鉴定及其分布

图1～4分别为抗性基因Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt在部分材料中的检测结果，表2为73份材料的检测结果。由表2可以看出，73份材料中有3个材料含有Pi-ta基因；10个材料含有Pi-9基因；13个材料含有Pi-b基因；72个材料含有Pi-zt基因。从表2还可以发现，73份供试材料中54个含有1个基因，13个含有2个基因，6个含有3个基因，未见含有4个基因的材料。

在检测的材料中，抗性基因Pi-zt的频率最高，检出率为98.6 %，其次为抗性基因Pi-b和Pi-9，检出率分别为17.8 %和13.7 %，检出频率最低的是Pi-ta，为4.1 %。

2.2 检测的抗稻瘟病基因数量、类型与抗病相关性分析

对4个抗性基因在73份水稻材料中的分布与抗性分析表明，73份材料中含3个基因的有6个，其中5个表现为抗性水平(Pi-9+Pi-b+Pi-zt)，1个表现为感性(Pi-ta+Pi-b+Pi-zt)；含2个基因的有13个，含Pi-b+Pi-zt有6个，5个表现为感性水平，1个表现为抗性水平(360A)，含Pi-9+Pi-zt有5个，4个表现为感性水平，1个表现为抗性水平(R669),含Pi-ta+Pi-zt有2个，均表现为感性水平，表明这几个基因聚合在一起抗性比较弱。含有1个基因的有54个，53个含有Pi-zt，1个含有Pi-b，54个中17个表现为抗性水平，16个含有Pi-zt的表现为抗性，1个含有Pi-b表现为抗性，这并不意味着2个基因的抗性水平高，应该是还携带着其他的抗性基因。

表1 用于PCR反应的引物名称、序列和扩增片段预期大小

M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182图1 部分材料Pi-ta基因的扩增Fig.1 PCR results of gene Pi-ta in some materials

M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: 理想S; 7: 川浙A; 8: 327B; 9: 泰丰A; 10: R146; 11: R387; 12: 蜀恢527; 13: R25; 14: 恩恢85; 15: 蜀恢527; 16: IR26; 17: 多丝一号; 18: IR26; 19: R669; 20: R208M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: LixiangS; 7: ChuanzheA; 8: 327B; 9: TaifengA; 10: R146; 11: R387; 12: Shuhui527; 13: R25; 14: Enhui85; 15: Shuhui527; 16: IR26; 17:Duosiyihao; 18: IR26; 19: R669; 20: R208图2 部分材料Pi-9基因的扩增Fig.2 PCR results of gene Pi-9 in some materials

M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182图3 部分材料Pi-b基因的扩增Fig.3 PCR results of gene Pi-b in some materials

M: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: 素92B; 7: 中嘉B; 8: 中88B; 9: 28早-1B; 10: 28早-2B; 11: 青56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: 川浙B; 19: 279-2B; 20: 283BM: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: Su92B; 7: ZhongjiaB; 8: Zhong88B; 9: 28Zao-1B; 10: 28Zao-2B; 11: Qing56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: ChuanzheB; 19: 279-2B; 20: 283B图4 部分材料Pi-zt基因的扩增 Fig.4 PCR results of gene Pi-zt in some materials

通过进一步分析在含Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt等不同的抗性基因对提升水稻抗性频率的贡献，结果显示，不同的抗性基因对提升水稻抗性的贡献不同，其中，携带Pi-b基因的材料中，表现为抗性材料的频率为61.5 %；携带Pi-9基因的材料中，表现为抗性材料的频率为60 %；携带Pi-zt基因的材料中，表现为抗性材料的频率为34.7 %。结果表明，Pi-b和Pi-9在汉中地区表现出较好的抗瘟性，对该地区的抗瘟性贡献较大。尤其是同时含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt3个基因的材料中，抗病率百分之百，表明3个基因聚合在一起，能够表现出较好的抗性。

表2 供试材料分子标记检测结果和抗性反应

续表2 Continued table 2

序号 Code材料名称Name of materialPi-taPi-9Pi-bPi-zt合计Total抗感性Reactions39909S---+1S40川106A--++2S41360A--++2R42理想S---+1S43川浙A-+-+2S44327B--++2S45泰丰A-+++3R46R146---+1R47R387---+1R48R25---+1S49恩恢85---+1R50蜀恢527+--+2S51IR26---+1R52多丝一号---+1R53R669-+-+2R54R208---+1R55R126--+-1R56R150---+1S57成恢727---+1R58R150+--+2S59成恢177+-++3S60IR24--++2S61R563---+1R62R225---+1R63R115---+1R64宜恢1108---+1S65R263-+++3R66R1025-+++3R67R1026-+++3R682208B---+1S69R675---+1R70R676---+1R71R491---+1R72R138---+1R73R182---+1R合计Total3101372

注：“+”含该基因；“-”不含该基因；R：抗病； S：感病。

Notes: ‘+’indicated that the gene were contained; ‘-’ indicated that the gene were not contained; R: Resistant; S: Susceptible.

3 讨 论

由于稻瘟病病菌具有耐药性、易变异等特点，因此，同一稻区和不同稻区的稻瘟病菌有所不同，品种的抗病性往往表现出巨大差异，导致单一抗性品种不能够长效的保持抗性。实践证明，培育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。传统的抗性育种主要依赖于表现型的特点，而表现型容易受环境以及人为因素的干扰，从而降低了选育结果的可靠性及抗病育种效率。而分子标记辅助选择技术不受外部环境的影响，分析手段快速简便，即保证了结果的可靠性，又能提高育种效率。因此，通过传统育种方法结合分子标记辅助选择技术是进行抗病育种的有效手段。刘仕平等[12]研究表明，多个抗性基因的聚合后，并不简单的是单个抗病基因的抗谱之间的简单累加，而是抗性基因之间表现为极显著的基因互作，从而促使抗谱拓宽，抗性增强，使其能够抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种。一个材料中含有的抗病基因数量越多，其抗性材料的出现频率可以得到相应提升，但是也不尽然，还需要看含有的抗性基因是否有显著的基因互作。为了减少基因聚合的盲目性，增加目的性和可靠性，通过分子标记了解水稻材料中的抗性基因背景。如李进斌[13]等和刘华招[14]等利用pita和pib抗性基因分子标记分别对云南种植稻种和黑龙江种植稻种中2个基因的分布进行了鉴定分析。时克等[15]利用分子标记检测了58个水稻品种的Pita和Pib基因的分布状况。何重等[16]利用Pi-ta和Pi-b基因标记，对江苏地区粳稻品种进行了基因检测，明确了抗性基因Pi-ta和Pi-b在江苏粳稻品种中的分布，且Pi-b的分布频率较高。张羽[17]等通过分子标记检测了陕西省水稻种质资源中Pi-9基因的分布状况，并指出陕西省主要水稻种质资源中Pi-9基因所占比例较少。戴小军等对70 个水稻稻瘟病感抗病品种进行了Pi-ta、Pi-b、Pi-9 以及Pi-km 基因检测，初步建立了抗性基因数据库。

4 结 论

本研究对汉中地区73份水稻材料进行了Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt基因检测，了解了4个基因的分布以及对抗稻瘟病的贡献。通过4个基因的分布频率以及贡献率发现，供试材料中4个基因都有分布，分别检测到有含3个基因，2个基因以及1个基因的材料，其中Pi-zt的分布频率最高，且大部分材料只含有这1个基因，大部分表现感病，个别表现出抗病，表现抗病的材料应该是含有其他抗性基因，而Pi-zt基因在抗病圃里应该是减弱或已丧失抗性。Pi-9和Pi-b的分布频率和贡献率差不多，在基因聚合中，Pi-b+Pi-zt有6个，5个表现为感性水平，1个表现为抗性水平，含Pi-9+Pi-zt有5个，4个表现为感性水平，1个表现为抗性水平，含Pi-ta+Pi-zt有2个，均表现为感性水平。而同时含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt的材料均表现为抗性。由于Pi-zt普遍存在，同时聚合Pi-9和Pi-b是提升材料抗性的一种手段。通过本研究，初步建立了抗性基因数据库，为聚合多基因提升水稻抗性提供依据。本实验所选材料和抗性基因较少，不能解决所隐藏的问题，如只含Pi-zt基因所表现抗性的材料，其还含有哪些基因来提升抗性；聚合3个或多个基因的材料抗性是否强于1个或2个基因的材料抗性等。下一步将继续扩大群体和基因数量，进一步完善汉中地区抗性基因数据库，为水稻抗病育种提供资源。