酸性矿业废水污染农田土壤剖面孔隙水中N、S转化功能基因丰度变化及其影响因素

徐欣如，查建军，张明珠，孙庆业

(安徽大学资源与环境工程学院，安徽 合肥 230601)

【研究意义】氮循环是N2、无机氮化合物、有机氮化合物在自然界中相互转化过程的总称，是重要的微生物化能过程，包括氨化、硝化、反硝化、固氮作用等[1]。由于氮转化过程涉及农田氮肥有效性、水体富营养化等，国内外学者在氮循环方面进行了广泛的研究。土壤中的硫主要以硫酸盐形式存在，硫酸盐的还原过程在土壤硫循环中占据位置，其主要执行者为硫酸盐还原菌[2]。因此研究土壤中氮硫转化功能基因及其与土壤元素循环过程的关系具有重要意义。【前人研究进展】目前，环境介质中参与氮、硫转化的功能微生物及其携带的基因受到了广泛的关注。研究表明，反硝化菌与厌氧氨氧化菌之间存在协同和竞争关系[3]，土壤层次的变化能够影响氨氧化的细菌群落结构和丰度[4]，C/N比大于6时，可限制上覆水中功能基因amoA-AOA的生长，抑制氨氧化过程的进行[5]，硫酸盐含量会影响硫酸盐还原过程[6]。作为一种环境介质，多种元素的转化过程在土壤中同时进行，且不同元素的生物地球化学循环过程相互联系、相互影响，如硫酸盐还原过程能够促进固氮过程、其产物能够抑制氨氧化过程[7]。土壤是固、气和液三相统一体，土壤中参与氮、硫循环的微生物除附着于土壤颗粒外，还有一部分生活于土壤的孔隙水中。目前，关于土壤中参与氮硫循环微生物的研究多以土壤整体作为研究对象[8-9]，而关于土壤孔隙水的研究多集中于孔隙水中的污染物质和理化指标分析[10]，对于土壤颗粒和悬浮于孔隙水中微生物的变化以及与孔隙水理化性质的关系还缺乏深入研究，土壤孔隙水的理化性质与参与氮硫转化功能基因丰度之间关系的研究相对较少。酸性矿业废水是含硫化物的矿物与水、氧气、微生物相互作用产生的，它们是矿山环境污染的重要来源[11]。酸性矿业废水的典型特点是低pH、高硫酸盐含量，以及含有大量的污染性金属离子[12]，这些废水不仅会造成地表和地下水污染，还会导致周边土壤质量退化，影响农作物的产量与品质[13]。目前针对酸性矿业废水污染土壤的研究侧重于重金属污染，而忽略了对土壤中微生物群落以及功能基因的影响。铜陵是我国有色金属基地之一，伴随矿产资源开采形成了大量的酸性矿业废水。这些酸性矿业废水通过不同的途径进入周围农田，并随着土壤孔隙水向下渗透进入深层土壤，从而对土壤造成污染。【本研究切入点】本研究以安徽省铜陵市某处受酸性矿业废水污染的农田作为研究对象，基于荧光定量PCR技术分析了土壤剖面不同深度孔隙水中某些参与N、S转化的功能基因的丰度，阐明受污染农田土壤孔隙水中影响参与氮硫转化的微生物功能基因丰度的主要因子，【拟解决的关键问题】为揭示酸性矿业废水污染农田土壤中的氮硫循环过程以及酸性矿业废水污染农田土壤生态修复提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于安徽省铜陵市某矿区附近(30°50′～30°58′ N，117°50′～118°10′ E)，为亚热带气候，无霜期有237～258 d，全年平均气温16.2 ℃，平均湿度在75 %～81 %之间，年均降雨量1346 mm，雨季集中在7-9月份[14]。所研究区域农田由于长期受酸性矿业废水的影响，具有低营养、高盐、高重金属的特点，农作物的产量较低，某些作物甚至无法生长。

1.2 样品采集与分析方法

1.2.1 水样的采集 在供试农田内设置4个采样点，每个采样点在0～20、20～40、40～60、60～80、80～100、100～150 cm各安装1根采水管( 图1)。采水管的设计为双层PVC管结构，内管外径3 cm、长度40 cm，管壁布设均匀小孔，内管外包裹400目的尼龙网，防止泥沙进入；外管外径5 cm、长度44 cm，上半段设有进水孔，外管两端用硅胶塞密封，并设置一根软管用于取水。为减少安装过程对土壤的扰动，钻孔后将采水管直接插入到预定深度，钻孔所用钻头的外径与采水管的外径一致。2016年8月完成采水管野外安装工作，采水管在土壤剖面中稳定1个月后，10月份采集土壤孔隙水样。

利用真空泵将孔隙水快速抽入到含2 cm厚石蜡层的灭菌样品瓶中。所采集的水样一部分用于测定孔隙水中的还原性物质(S2-)，另一部分水样过0.22 μm滤膜后用于测定水样的其他理化性质，滤膜上的残留物用于提取水中的微生物DNA及功能基因分析。

图1 土壤孔隙水采集管示意图Fig.1 Illustration of design used to monitor pore water

功能基因Target gene引物Primers引物序列 (5’-3’)Prime sequence (5’-3’)amoA-AOAamoA-1F/amoA-2RGGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCKGSAAAGCCTTCTTCamoA-AOBArch-amoAF/Arch-amoARSTAATGGTCTGGCTTAGACGGCGGCCATCCATCTGTATGTnirKCd3aF/R3cdGTSAACGTSAAGGAACSGGGASTTCGGRTGSGTCTTGAnirSnirK876/nirK1040ATCATGGTSCTGCCGCGGCCTCGATCAGRTTGTGGTTnosZnosZ2F/nosZ2RCGCRACGGCAASAAGGTSMSSGTCAKRTGCAKSGCRTGGCAGAAdsrBDSRp2060F/DSR4RCAACATCGTYCAYACCCAGGGGTGTAGCAGTTACCGCA

微生物总DNA采用CTAB法提取[12]。荧光定量PCR(qPCR)技术测定孔隙水中各功能基因的丰度[2,17]。qPCR反应在ABI step-one system扩增仪上根据KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix试剂的说明书进行，产物的特异性用溶解曲线以及凝胶电泳确定，不同功能基因的qPCR引物及引物序列见表1[18-23]。qPCR的扩增效率为80 %～90 %，标准曲线R2> 0.99。

1.3 数据分析方法

Excel 2007用于计算平均值和标准误，并绘制表格；SPSS 19.0用于差异显著性检验( Duncan法) 和相关性分析( Pearson法)。

2 结果与分析

2.1 土壤剖面孔隙水理化性质

2.1.1 土壤剖面孔隙水的pH和电导率 从表2可以看出，土壤剖面孔隙水pH的变化范围为7.06～7.33，EC的变化范围为104～199 μs/cm。随着剖面深度的增加，孔隙水pH逐渐降低，而EC则呈现相反的变化趋势。pH的最小值及EC的最大值均出现在80～100 cm剖面层，其中，0～20 cm剖面层的pH显著高于80～100 和100～150 cm(P<0.05)，而0～20 cm剖面层的EC则显著低于80～100 和100～150 cm(P<0.05)。上述结果表明，土壤剖面孔隙水的pH和EC随剖面深度变化较为明显。

2.2 土壤剖面孔隙水中N、S代谢功能基因的丰度

如表4所示，土壤孔隙水0～20 cm层功能基因amoA-AOA与amoA-AOB的比率约为5，随着剖面深度的增加，二者的比率也逐渐增加，100～150 cm层时二者的比率达到38.92；各层孔隙水中nirS基因丰度均大于nirK；5种参与N转换的功能基因中，nosZ基因丰度最大。参与硫还原功能基因dsrB的丰度整体上高于参与N转换的功能基因，且在60～80 cm层时丰度达到最大，为1.96×109copies/mL。统计检验表明，不同剖面深度6种功能基因丰度均无显著差异。

表2 孔隙水中C、N含量(平均值±标准误)

注：同一列中不同字母表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

Notes: Different letters within a column indicate the significant differences among treatments at 0.05 level. The same as below.

表3 孔隙水中污染物特征(平均值±标准误)

如表5所示，土壤剖面孔隙水中参与氨氧化的功能基因amoA-AOA与amoA-AOB呈显著正相关(P<0.05)，参与反硝化的3个功能基因nirS、nirK、nosZ呈显著或极显著正相关。来自于氨氧化古菌的amoA-AOA与反硝化功能基因nirS、nirK和nosZ也呈显著或极显著正相关，但源于细菌的amoA-AOB仅与nirK具有较好的相关性。

2.3 功能基因丰度与孔隙水理化性质的相关性

如表6所示，不同环境因子对N、S转化功能基因丰度的影响，其中，EC、亚硝氮与dsrB基因呈显著正相关(P<0.05)；Cu与amoA-AOA、nirS基因呈显著正相关(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 土壤孔隙水中功能基因的关系

氨氧化过程将氨氧化为亚硝氮，是硝化作用的第一个反应步骤，既是限速步骤，也是氮循环的中心环节[24]。参与氨氧化的功能基因amoA-AOA与amoA-AOB的比率在一定程度上可以反映环境氧含量、营养等条件。Santoro[25]在测定地下河口沉积物中amoA基因丰度时发现，amoA-AOA在低氧环境中是amoA-AOB的10倍，但在好氧环境中amoA-AOB却是amoA-AOA的约30倍。在本研究中，随着土壤剖面深度的增加，参与氨氧化的功能基因amoA-AOA与amoA-AOB丰度的比率也逐渐增加，0～20 cm层时amoA-AOA/amoA-AOB比率约为5，而在100～150 cm层时，amoA-AOA与amoA-AOB的比率增加到约39。这种比率的变化趋势可能与功能基因的生理代谢机制有关，在系统发育与进化方面，amoA-AOA形成了一类完全独立于amoA-AOB的进化分支，它既可进行自养代谢，也可以通过混合营养方式生活[26]，因此，在氧气含量不充足的情况下，amoA-AOA的丰度优势逐渐明显。与土壤剖面0～20 cm层相比，位于100～150 cm深度的土壤孔隙水中基本处于厌氧状态，这也是导致该层具有较高amoA-AOA丰度的原因。

表4 土壤孔隙水中参与N、S代谢功能基因的丰度(copies/mL，平均值±标准误)

表5 孔隙水中N、S代谢功能基因的相关性

注：*表示在0.05水平上具有显著相关性，**表示在0.01水平上具有显著相关性，下同。

Notes: *stand for significance at 0.05 level, and **stand for significance at 0.01 level. The same as below.

表6 孔隙水中N、S代谢功能基因与理化性质的相关性

相关分析(表5)还表明，孔隙水中参与氨氧化过程和反硝化过程的功能基因之间存在较好的相关性，可能是由于氨氧化过程增加了氧化态氮的供应，从而促进了反硝化过程的进行[28]。

有研究表明，硫酸盐还原过程对反硝化过程存在双方面的影响：一方面，硫酸盐还原过程的中间产物(单质硫)，可以作为部分自养反硝化菌的电子供体[29]；另一方面，硫酸盐还原过程会对反硝化过程中氧化亚氮还原为氮气阶段的酶(nosZ编码的酶)产生抑制作用，使得反硝化过程无法完全进行[30]。本研究中，dsrB基因与参与N转化的功能基因之间并未表现出相关性(表5)，具体原因有待于进一步探讨。

3.2 土壤孔隙水理化因子对功能基因丰度的影响

酸性矿业废水进入农田后不仅可导致土壤中Fe、Mn、Cu及硫酸根含量的增加[31]，而且还会影响土壤微生物的群落结构[32]。在本研究中，土壤孔隙水中Cu对amoA-AOA基因丰度起到了显著促进作用(r= 0.430，P<0.05)。Walker[33]在对海洋中硝化机制进行研究时发现，amoA-AOA基因的能量代谢依赖于含有Cu而非Fe的电子传递系统，这可能会影响氨氧化菌对重金属Cu 的敏感性，这也可能就是本研究孔隙水中amoA-AOA基因丰度与重金属Cu含量呈显著正相关性的原因。

在本研究中，孔隙水中dsrB基因丰度与EC呈显著正相关(r= 0.412，P<0.05)。硫酸盐还原菌主要参与硫酸根的还原作用[34]，酸性矿业废水中主要的阴离子即为硫酸根离子[35]，而硫酸根又是决定酸性矿业废水电导率的关键因素，因此dsrB基因丰度与EC呈显著正相关是很容易理解的。

4 结 论

酸性矿业废水污染土壤剖面的孔隙水中参与N、S转化的6种功能基因丰度受剖面深度的影响较小，但amoA-AOA与amoA-AOB丰度的比率则随着剖面深度的增加而增加；nirK基因对环境因子的响应较nirS更为敏感，基因丰度整体上低于nirS基因；5种参与N转化的功能基因(amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ)之间表现出较好的相关性；土壤孔隙水的EC、亚硝氮含量影响dsrB基因的丰度，孔隙水中Cu对amoA-AOA和nirS基因丰度产生显著影响。总的来说，酸性矿业废水污染农田土壤剖面孔隙水中氮转化功能基因之间相互作用，功能基因丰度与剖面深度和孔隙水理化性质关系密切。