酶水解法测定滇黄精淀粉含量的工艺优化

李彦莹，朱新焰，石亚娜，杨发建，季鹏章*，王家金

(1.云南农业大学食品科技学院，云南 昆明 650223；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650092；3.保山中医药高等专科学校，云南 保山 678000)

【研究意义】黄精是百合科多年生草本植物[1]，已有2000多年药用历史[2]，被广泛的应用在日常生活中，目前已有150余种中成药和170余种保健品以黄精作为原料进行生产加工[3]。据《云南省人民政府关于加快中药(民族药)产业发展的指导意见》指出，要加快发展石斛、灯盏花、血竭、银杏、滇黄精等优势特色药材，预计到2020年，云南省中药(民族药)总产值达到1400亿元，滇黄精作为黄精的基原植物之一[4]，具有巨大的市场潜力。【前人研究进展】滇黄精既是云南道地药材，又是药食同源的植物[5]。多糖作为黄精主要药理活性成分[6]被广泛关注，但作为植物多糖类的淀粉在滇黄精中还未有研究，王庆南[7]认为甘薯的理化特性与口感品质有一定关联性，刘文静[8]研究发现淀粉与甘薯口感呈正相关关系，因此滇黄精作为一种药食同源植物对其淀粉含量测定方法进行研究极有必要。【本研究切入点】目前对淀粉含量的测定有苯酚硫酸法、DNS法、还原糖测定仪法、高氯酸法、碘显色法、近红外光谱法、酶解蒽酮比色法[9-12]等方法，常见于玉米、烟叶、稻米、甘薯、莲藕、马铃薯[9-14]等植物的淀粉测定研究，目前没有针对滇黄精淀粉含量的测定标准。【拟解决的关键问题】本试验旨在对GB5009.9-2016中酶水解法测定工艺进行优化，得到酶水解测定滇黄精淀粉含量的最佳工艺，以期为滇黄精淀粉的后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

滇黄精干燥块茎，采于云南省农业科学院药用植物研究所滇源基地，经季鹏章研究员鉴定为百合科植物滇黄精(Polygonatumkingianum)。高峰α-淀粉酶 Solarbio科技有限公司，活性40 000 U/g；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DK-S28型数显恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；CP153型分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；XM-2500Y型多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司)；DK-98-I型电炉(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取液制备 干燥块茎→粉碎(过50目筛)→脱脂→脱糖→糊化(沸水浴15 min)→冷却→淀粉酶酶解(57 ℃、1 h)→灭酶→定容→过滤→酸水解(沸水，55 min)→冷却调pH(NaOH)→定容。

1.3.2 淀粉含量测定 酶水解法(GB 5009.9-2016)。

1.3.3 滇黄精淀粉含量计算

(1)

(2)

(3)

式中,X1为所称试样中葡萄糖的质量，单位为mg；m2为标定10 mL碱性酒石酸铜溶液时消耗的葡萄糖标准溶液体积与加入试样后消耗的葡萄糖标准溶液体积之差，为葡萄糖的质量，单位mg；m1为10 mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，单位为mg；V1为标定碱性酒石酸铜溶液时消耗的葡萄糖标准溶液体积；V2为加入试样后消耗的葡萄糖标准溶液体积；X为试样淀粉含量，单位为g/100g；X0为试剂空白值，单位mg；m为试样质量，单位g。

表1脱糖次数对滇黄精淀粉含量测定的影响

Table 1 The effect of desugar times on the determination of starch content of Dianhuangjing

脱糖次数The desugar times淀粉含量(g/100g)The content of starch相对标准偏差(%)Relative standard deviation43.432.3253.172.0463.111.8773.071.8883.041.79

1.3.4 单因素试验 分别以脱糖次数(4、5、6、7、8次)、酶解温度(51、53、55、57、59 ℃)、加酶量(15、20、25、30、35 mL)、酸水解时间(50、55、60、65、70 min)进行单因素试验。

1.3.5 正交试验 根据单因素试验结果，以淀粉含量为考察指标，对脱糖次数、酶解温度、加酶量、酸水解时间进行L9(34)正交试验，得出最佳测定提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 脱糖次数对滇黄精淀粉含量测定的影响 在酶解温度55 ℃、加酶量20 mL、酸水解时间60 min的条件下，分别进行4、5、6、7、8次脱糖，测得结果如表1所示。随着脱糖次数的增加，淀粉含量逐渐减少，当脱糖次数大于6次时，测定结果趋于稳定，可能是滇黄精中的可溶性糖已经大致去除。所以确定6次为最佳脱糖次数。

2.1.2 酶解温度对滇黄精淀粉含量测定的影响 表2所示，脱糖次数为6次，其他条件与2.1.1一致，滇黄精淀粉含量差距不明显，但酶解温度高于55 ℃误差较稳定，低于55 ℃可能由于温度较低，酶解过程不稳定。考虑到温度保持的准确程度，确定57℃为最佳酶解温度。

2.1.3 加酶量对滇黄精淀粉含量测定的影响 表3所示，酶解温度57 ℃，其他条件与2.1.2一致，滇黄精淀粉含量大于20 mL加酶量基本趋于稳定，无明显变化，说明当加酶量达到一定值后达到饱和，但相对标准偏差随加酶量增加而逐渐增大，可能饱和后多余的酶液对后续的测定造成影响。所以确定20 mL为最佳加酶量。

表2酶解温度对滇黄精淀粉含量测定的影响

Table 2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the determination of starch content of Dianhuangjing

酶解温度(℃)Enzymatic hydrolysis temperature淀粉含量(g/100g)The content of starch相对标准偏差(%)Relative standard deviation513.082.56533.092.47553.072.12573.081.87593.111.75

表3加酶量对滇黄精淀粉含量测定的影响

Table 3 The effect of enzyme concentration on the determination of starch content of Dianhuangjing

加酶量(mL)Enzyme concentration淀粉含量(g/100g)The content of starch相对标准偏差(%)Relative standard deviation153.141.61203.151.74253.182.38303.172.41353.172.55

2.1.4 酸水解时间对滇黄精淀粉含量测定的影响 表4所示，加酶量20 mL，其他条件同2.1.3，随着酸水解时间的延长，滇黄精淀粉含量不断增加，在60 min时涨幅最大，之后涨幅减小，且相对标准偏差在60 min内较小，超过60 min可能水解出其他糖类物质，所以酸水解60 min为最佳时间。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，以脱糖次数、酶解温度、加酶量和酸水解时间为正交试验因素，每个因素设计3个水平，因素和水平、结果见表5。极差分析可知，各影响因素对测定滇黄精淀粉含量的影响程度依次为加酶量﹥酸水解时间﹥脱糖次数﹥酶解温度，酶水解法测定滇黄精淀粉含量的最佳工艺条件为A1B2C1D3，既脱糖次数为5次、酶解温度为57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解65 min。

表4酸水解时间对滇黄精淀粉含量测定的影响

Table 4 The effect of acid hydrolysis time on the determination of starch content of Dianhuangjing

酸水解时间(min)Acid hydrolysis time淀粉含量(g/100g)The content of starch相对标准偏差(%)RSD502.882.13553.092.52603.281.67653.432.43703.462.79

如表6所示，加酶量对滇黄精淀粉含量影响显著，脱糖次数、酶解温度和酸水解时间不显著，说明加酶量是一个重要因素，根据表5结果结合现实操作成本，最佳工艺定为A1B2C1D1，即脱糖次数为5次、酶解温度为57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解55 min。

3 讨 论

脱糖次数对淀粉含量没有显著影响，可能滇黄精中可溶性糖含量不高。酸水解时间对滇黄精淀粉含量测定影响不显著，可能与单因素试验的温度范围跨度太大有关，而正交试验的时间跨度太小导致不显著(Sig值>0.05)。酶解温度对滇黄精淀粉含量测定影响不明显，可能与酶解温度只影响样品液提取的前一部分而对过滤后酸水解部分影响不大有关，故以后可采取分段正交优化试验研究滇黄精淀粉含量测定条件。

表5 酶水解法测定滇黄精淀粉含量正交优化试验

表6 方差分析

注：**表示差异极显著(Sig<0.01)；*表示差异显著(Sig<0.05)。

Notes: ** indicated particularly significant difference (Sig<0.01); * indicated significant difference (Sig<0.05).

目前还没有对滇黄精的淀粉种类及结构特性进行相关研究，不能确定某部分操作工艺条件是否会对滇黄精淀粉含量测定具有显著影响。Mehrnoush Amid[15]研究，红龙果皮中的淀粉酶具有很好的热稳定性，温度对红龙果淀粉酶影响不大，而Ornanong S. Kittipongpatana[16]研究，菠萝蜜种子中的抗性淀粉受水分和温度影响，与处理时间影响不大；当高静水压与α-淀粉酶同时作用，酶浓度越高，淀粉溶解度越高[17]。上述研究在没有了解滇黄精淀粉种类和比例结构前不具有参考意义，下一步应该从滇黄精的淀粉种类和含量结构进行研究，以期明确滇黄精淀粉含量测定工艺过程和起显著影响作用的因素。

4 结 论

研究结果表明，各条件因素对酶水解法测定滇黄精淀粉含量的影响程度依次为加酶量﹥酸水解时间﹥脱糖次数﹥酶解温度。其中，加酶量对滇黄精淀粉含量影响显著，其余条件不显著。酶水解法测定滇黄精淀粉含量的最佳工艺条件为脱糖次数为5次、酶解温度为57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解55 min。